靶向角蛋白17反义寡核苷酸和siRNA对银屑病SCID小鼠模型的治疗作用

摘要

银屑病是一种常见的慢性炎症性皮肤病，一定的遗传背景、感染作为诱因、以T细胞为主的细胞免疫紊乱是银屑病发病机理中的三个重要环节。角蛋白17（K17）是相对分子量（Mr）为46000的Ⅰ型角蛋白，在正常表皮不表达（主要分布在生长期毛囊、汗腺等组织），而在银屑病皮损处呈高表达。研究发现，K17与链球菌M蛋白具有交叉抗原特性，其表面含有多个T淋巴细胞活化表位，能够刺激T细胞，使之活化、增生、释放炎症因子γ干扰素（IFNγ）等，而IFNγ又能够诱导增加K17的表达，从而在K17和T细胞之间形成一个相互促进的环路，导致炎症反应和表皮细胞异常增生等病理改变，是银屑病发病机理中的重要环节。鉴于K17在银屑病病理过程中的特殊意义和关键作用，我们提出将K17作为治疗银屑病的一个新的药物作用靶点，探讨更加特异和有效的治疗策略。 我们以往的研究发现，抗角蛋白多克隆自身抗体和抗角蛋白17单克隆抗体均能够以剂量依赖的方式抑制表皮角质形成细胞（KC）的增生，在银屑病体外模型和普萘洛尔诱导的银屑病样皮炎动物模型中，均可以逆转包括KC异常增生、炎症性细胞因子过度表达等在内的一系列病理改变，显示出对银屑病良好的治疗效果。在此基础上，本课题组应用反义技术及RNA干涉（RNAi）技术，将针对K17的反义寡核苷酸（K17－ASODN）以及小干涉RNA（K17－siRNA）转染体外培养的角质形成细胞，结果发现二者均能抑制角质形成细胞的增生，并诱导其凋亡。 本研究的目的是通过在体实验进一步验证K17－ASODN和siRNA对银屑病的治疗作用，确认K17作为治疗银屑病的药物作用靶点。我们采用目前公认的重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠银屑病皮损移植模型，将K17－ASODN和siRNA用脂质体包裹，局部外用于移植皮损，继而通过移植皮片的大体改变和组织病理学等特征观察治疗效果，并采用反转录PCR（RT-PCR）以及免疫组化的方法分别从核酸及蛋白水平检测了K17的变化，为研究银屑病新的基因治疗策略进行了积极的尝试。 本研究的主要实验方法及结果如下： 一、银屑病SCID小鼠动物模型的构建 1. 供体、受体来源 移植皮片均来自我科新入院、本次入院前未作任何治疗的斑块型银屑病患者，所有患者均签署知情同意书，并经第四军医大学西京医院伦理委员会审查许可。SCID小鼠（6-8周龄）购于上海斯莱克实验动物中心，饲养于本校实验动物中心(SPF环境)。 2. 动物模型的构建 切取银屑病患者皮损约5×5cm2大小，作为移植供体。将所获取的皮片剪成直径为0.8cm2的正方形皮片5小块，分别移植给5只SCID小鼠。移植后10天，移植皮片周围分点皮下注射经刀豆蛋白刺激的银屑病患者外周血单一核细胞（PBMCs），细胞数约为1×106/鼠。移植后15天，绝大多数移植皮片外观和组织病理学特征呈明显的银屑病改变。我们根据Baker评分法，对所有的移植模型进行评分，结果为8.042±0.838，免疫组化提示移植表皮基底层上方KC高表达K17。因此从大体表现、组织病理和免疫学方面，移植皮片均能保留银屑病的表型特点，表明银屑病SCID小鼠动物模型构建成功。 二、K17－ASODN对银屑病SCID小鼠模型的作用 1. K17－ASODN的合成 按我们以往建立的方法，设计针对K17mRNA蛋白编码区位点的有效ASODN序列：5’GCCAGCAGCCCATCAACA 3’，另外合成一段正义寡核苷酸（SODN）序列作为对照：5’TGTTGATGGGCTGCTGGC 3’。二者均经硫代磷酸化修饰，由上海生物技术公司合成。 2. 分组及给药 将构建好的动物模型随机分为3组，每组4只，分别对应以下处理：K17- ASODN治疗组：15μg（5μl）K17-ASODN 加30μl脂质体，临时配制于25μl乳剂基质中，均匀涂抹于移植皮片，间隔2天给药一次，连续给药5次，疗程15天；K17-SODN对照组：以K17-SODN取代ASODN，剂量、配制及外用方法同ASODN组；乳剂基质对照组：30μl 乳剂基质加30μl 脂质体，用法同上。 3．结果 治疗后15天比较各组治疗效果： 移植皮片外观改变：ASODN组治疗后移植皮片红斑、鳞屑消失，几乎接近于正常皮肤，而对照组皮损仍保持明显红斑，可见白色鳞屑，同治疗前相比无明显改变。各处理组均未见任何不良反应。 移植皮片组织病理学特征：治疗组表皮显著变薄、炎细胞浸润减轻、组织学评分显著降低；而对照组表皮厚度几乎保持不变，尽管角化不全消失，部分颗粒层出现，但仍可见角化过度、棘层肥厚、表皮突延长、真皮浅层毛细血管扩张、充血以及炎细胞浸润等银屑病改变。 RT-PCR结果：在内参照β-肌动蛋白表达量基本一致的情况下，SODN及乳剂基质对照组出现特异的K17基因条带，而ASODN组K17基因条带亮度明显减弱。 免疫组化结果：ASODN组治疗后基底层上方角质形成细胞胞浆染色不明显，K17阳性细胞明显减少；SODN组及乳剂基质对照组治疗前后K17表达水平无显著变化。 三、靶向K17的siRNA对银屑病SCID小鼠模型的作用 1. siRNA重组质粒的制备 K17编码基因的siRNA表达质粒由本课题组先前构建，命名为psilencer3.1/K17，无关dsRNA对照为psilencer3.1/neg。本实验采用试剂盒大量提取重组质粒，酶切鉴定为正确序列。 2. 分组及给药 将已构建好的动物模型随机分为3组，每组4只。分别将K17-siRNA目的质粒、对照质粒5μl用30μl脂质体包裹，使其终浓度为3μg/μl，临时配制于25μl乳剂基质中；乳剂基质对照组则仅用乳剂基质30μl与脂质体30μl混匀；均匀涂抹于移植皮片，间隔2天给药一次，连续给药5次，疗程15天。 3. 结果 靶向K17的siRNA治疗后，可见移植皮片红斑、鳞屑消失；组织病理学显示表皮较治疗前变薄、炎细胞浸润减轻、组织学评分降低；RT-PCR及免疫组化结果显示K17mRNA及蛋白水平下降。而对照质粒组及乳剂基质对照组移植皮片外观仍呈明显红斑，组织学显示表皮较厚，可见角化过度、棘层肥厚，真皮炎细胞浸润等改变，K17mRNA及蛋白水平与治疗前相比，未见明显改变。各处理组均未见任何不良反应。 本研究将进行期斑块型银屑病患者的皮损移植于SCID小鼠，并辅以刀豆蛋白A活化的PBMCs刺激，成功构建了理想的银屑病动物模型。在这一基础上，外用靶向K17－ASODN和siRNA进行治疗，发现二者均可明显促进SCID小鼠银屑病样皮损的恢复，具有良好的治疗效果，不仅明确了K17可以作为治疗银屑病的一个新的药物作用靶点，而且还为靶向K17的银屑病基因治疗向临床应用的过渡奠定了基础。