大鼠切牙Apical bud和磨牙Hertwig's上皮根鞘细胞生物学性质研究

摘要

牙齿是由口腔上皮和神经嵴来源的外胚间充质相互作用而形成的。人类牙齿的发育，经历蕾状期、帽状期、钟状期、牙根发育和牙齿萌出期。人类的牙齿和啮齿类动物的磨牙在牙冠发育完成以后，成釉器内釉、外釉上皮细胞在颈环处增生，形成两层上皮结构，即Hertwig’s上皮根鞘（Hertwig’sepithelialrootsheath，HERS），标志着牙根发育的启动。而啮齿类动物（如大鼠、小鼠）的切牙终生不发育形成典型牙根结构，且终生不断萌出。研究认为，在切牙的末端存在apicalbud结构，其中有成体干细胞，后者不断缓慢分裂增生，分化为成釉细胞，形成釉质，使得切牙不断生长。那么HERS和apicalbud这两种来源于成釉器的牙上皮细胞究竟有着怎样的生物学性质，它们之间又有怎样的差异而导致形成两种完全不同的发育模式呢？本课题的目的是研究这两种上皮细胞的生物学性质，寻找其间的差异，为牙根发育机制的研究提供实验依据。
　　本课题采用组织学、免疫组织化学、细胞培养、RT-PCR、蛋白质组学和体内种植等技术方法进行了以下四部分实验研究，主要研究内容和结果如下：
　　第一部分apicalbud和HERS组织学研究
　　实验一：采用组织学方法观察了出生后（postnatal,PN）0-10dSD大鼠切牙apicalbud和磨牙HERS的组织学结构，结果发现：apicalbud位于切牙胚唇侧末端，PN0d即已形成，为三层细胞构成的上皮结构，含有内、外釉上皮，及其间的星网层细胞，星网层细胞含量非常丰富，使得apicalbud成为球形结构深入末端牙乳头组织中。HERS在PN7dSD大鼠磨牙胚颈部形成，为内、外釉上皮两层细胞构成，星网层细胞消失，而呈连续的扁平状结构。
　　实验二：采用免疫组织化学方法观察了FGF10,Notch1,BMPs在apicalbud和HERS组织中的表达。结果发现：FGF10在apicalbud周围牙乳头细胞中表达，而HERS内侧牙乳头细胞表达阴性；Notch1表达于apicalbud中；BMPs在HERS中表达。表明虽然有着共同的发育起源，但是一些特异的调控因子表达存在差异。提示牙根发育启动存在特异性的调控机制。
　　实验三：采用透射电镜方法，观察apicalbud和HERS超微结构。结果：apicalbud中部分细胞胞膜增厚，形成桥粒样细胞连接，部分细胞中间丝丰富，并呈类似黏液上皮样细胞形态。HERS两层上皮细胞整齐排列，内层为柱状或立方状细胞，细胞之间胞膜相嵌、融合，形成紧密连接。
　　第二部分apicalbud和HERS细胞生物学性质研究
　　实验一：通过机械分离切牙胚颈部唇侧末端和磨牙胚颈部组织，酶消化法原代混合培养，10％FBSDMEM/F12培养液连续培养，差别胰酶消化法进行细胞纯化的方法，分别培养apicalbud和HERS细胞。结果发现：在10％FBSDMEM/F12培养液中原代细胞生长状态良好，增殖迅速，经3次差别消化得到纯化的上皮细胞。免疫细胞化学实验证实得到的细胞为上皮细胞。
　　实验二：通过MTT检测、流式细胞术、免疫细胞化学、茜素红染色和RT-PCR等方法对apicalbud和HERS细胞一些生物学性质进行了初步研究。结果发现：apicalbud细胞表达Amelogenin,Ameloblastin,Notch1,而HERS细胞表达BMP2,4。体外培养的apicalbud细胞有矿化形成能力。
　　第三部分apicalbud和HERS细胞差异蛋白质组学研究
　　实验一：通过双向凝胶电泳实验对apicalbud和HERS细胞蛋白表达谱进行研究和对比。结果发现：apicalbud和HERS细胞差异表达蛋白有145个，相对于apicalbud细胞，HERS细胞表达的蛋白新增36点,缺失23点,有68点表达上调,有18点下调。
　　实验二：通过肽质量指纹谱方法对实验一得到的差异蛋白进行研究，结果：鉴定出10个蛋白质，其功能涉及细胞的氧化还原反应、酶活性等方面。
　　第四部分apicalbud和HERS细胞与牙乳头细胞团体内种植实验研究
　　利用体外培养的apicalbud和HERS细胞分别与切牙和磨牙胚牙乳头细胞重组后，细胞团种植于大鼠肾被膜下。结果发现：apicalbud和切牙牙乳头细胞团形成组织结构规则的釉质和牙本质组织，HERS细胞与磨牙牙乳头细胞团形成了骨样牙本质样组织。表明apicalbud和牙乳头细胞间可以相互诱导，分化出成釉细胞和成牙本质细胞，形成牙体组织，HERS细胞能够诱导牙乳头细胞分化为成牙本质细胞。

目录

缩 略 语 表

中文摘要

英文摘要

前 言

文献回顾

一 Hertwig’s 上皮根鞘在牙根发育中作用的研究

参 考 文 献

二 牙源性上皮干细胞研究进展

参 考 文 献

三 蛋白质组学研究进展

参 考 文 献

实验研究

实验 1 apical bud 和 HERS 组织学结构观察

实验 2 FGF10、Notch 1 和 BMPs 在 apical bud 和 HERS及周围组织中的表达

实验 3 apical bud 和 HERS 超微结构观察

第 一 部 分 小 结

参 考 文 献

第二部分 apical bud 和 HERS 细胞生物学性质初步研究

实验 1 apical bud 和 HERS 细胞培养和生长特性观察

实验 2 apical bud 和 HERS 细胞生物学性质的初步研究

第二部分小结

参 考 文 献

全 文 总 结

附 图

个 人 简 历

致谢