活性氧调控炎性细胞因子表达与高血压心脏重构的关系及辛伐他汀干预研究

摘要

研究背景及目的: 高血压是心血管疾病最重要的危险因素，而心脏重构是导致高血压患者心血管事件发生率显著增加的独立危险因素，是心脏功能由代偿向失代偿转化的重要病理表现。因此，心脏重构的发病机制和防治研究已成为国内外热点研究课题。现已明确，神经体液因素的异常激活是心脏重构发生的重要机制，但在多种神经体液因素阻断治疗已成为高血压常规治疗的今天，仍然无法阻遏心脏功能向失代偿发展的最终趋势，心力衰竭发病率仍然居高不下。目前，随着对炎症反应在多种心血管疾病发病机制中作用的认识，炎性细胞因子作为炎症反应的重要介质，已经成为与心血管疾病相关的另一类重要的神经体液因素。大量研究表明，炎性细胞因子可通过诱导心肌细胞肥大、细胞凋亡、调节细胞外基质的合成和降解等多种途径参与心脏重构的形成。此外，心肌内多种组成细胞可以与炎症细胞一样合成炎性细胞因子，通过自分泌和旁分泌方式影响心肌组织的损伤、修复和结构的改变。 本课题组以往研究显示，他汀类药物可抑制心肌细胞肥大以及心脏成纤维细胞增殖和胶原合成；在自发性高血压大鼠模型中也证实，辛伐他汀(Sim)可延缓心肌肥厚的发展。这些研究提示他汀类药物可调控心脏重构过程，但其分子机制仍不十分清楚。本课题动态观察高血压大鼠心肌组织炎性细胞因子表达特点及其与心脏重构和心功能变化的关系；研究ROS在心肌组织和心肌细胞炎性细胞因子表达机制中的作用；初步探讨Sim 对高血压心脏重构的防治作用及其分子机制。旨在炎症介质角度阐明高血压心脏重构的发病机制和他汀类药物防治心脏重构的分子机制。为高血压心脏重构的防治提供新思路和理论依据。 研究方法:本研究先后以压力负荷高血压大鼠和体外培养的新生SD大鼠心肌细胞为实验模型，采用组织病理学分析、心脏超声检查、血流动力学分析、比色法、荧光探针技术、细胞色素C 还原试验、ELISA、RT-PCR、Westernblot等方法和技术，动态观察：(1) 压力负荷大鼠心肌组织内促炎因子TNF-α、IL-6 和抗炎因子IL-10 表达变化及其与心脏结构和功能的关系；(2) 压力负荷大鼠对心肌组织ROS 水平及NADPH 氧化酶活性的影响；(3) 脂多糖（LPS）对心肌细胞内ROS 水平、NADPH 氧化酶活性以及p38 MAPK 活性的影响；(4) 抗氧化剂氮乙酰半胱氨酸（NAC）干预对心脏重构以及心肌组织和心肌细胞炎性细胞因子表达的影响；(5) Sim 干预对心脏重构以及心肌组织和心肌细胞ROS 水平和炎性细胞因子表达的影响。 研究结果: (1) 腹主动脉缩窄（AC）组大鼠血压在1周时就显著高于假手术（Sham）组，2周后左室重量指数（LVWI）、室壁厚度、心肌细胞内径、心肌组织胶原含量与Sham组比较明显升高，4周后左室舒张功能降低，随着观察时间的延长，这些改变进行性发展。在8 周的观察时间内未发现左室收缩功能障碍。 (2) AC组大鼠心肌组织内促炎因子TNF-α、IL-6以及抗炎因子IL-10 mRNA表达水平在2周后开始明显升高，在4周时达到最高水平，分别比Sham组升高116％、183％、83％。 (3) AC组大鼠心肌组织内TNF-α、IL-6和IL-10蛋白表达水平在4周时明显升高，分别比Sham组升高179％、114％和38％。而AC组和Sham组之间血清内这些炎性细胞因子的蛋白表达水平无显著性差异。 (4) 相关分析结果显示，心肌组织TNF-α、IL-6蛋白表达水平与心肌胶原蛋白含量、左室舒张末期压力均呈显著正相关，而与心肌细胞内径无显著相关性。心肌组织IL-10蛋白表达水平与胶原蛋白含量、LVEDP以及心肌细胞内径均无明显相关关系。 (5) AC组大鼠心肌组织ROS水平和NADPH氧化酶活性在1周时即显著升高，与Sham组比较有非常显著性差异。2周时达到最高水平，分别比Sham组升高140％和114％ ，4周和8周组ROS水平和NADPH氧化酶活性有所下降，但与对照组比较仍有非常显著性差异。 (6) NAC治疗后，压力负荷大鼠LVWI、室壁厚度、胶原含量以及左室舒张功能均明显改善，而血压和心肌细胞内径无显著变化。心肌组织TNF-α、IL-6 mRNA和蛋白表达水平均明显下降，与AC组比较有非常显著性差异。而两组之间IL-10 mRNA和蛋白表达水平无显著性差异。 (7) 早期或晚期给予Sim治疗后，压力负荷大鼠血压虽然无明显变化，但LVWI、室壁厚度、胶原含量、心肌细胞内径以及左室舒张功能均明显改善。而且Sim早期治疗组对各指标的干预效果明显优于Sim晚期治疗组。 (8) 早期或晚期给予Sim治疗后，压力负荷大鼠心肌组织TNF-α、IL-6 mRNA和蛋白表达水平明显下降，与AC组比较有显著性差异，而且Sim早期治疗组与Sim晚期治疗组之间亦有显著性差异，早期治疗组TNF-α、IL-6表达水平下降得更为明显。Sim治疗对IL-10 mRNA和蛋白表达水平无显著性影响。 (9) Sim治疗后，压力负荷大鼠心肌组织ROS水平和NADPH氧化酶活性明显降低，而且与Sim晚期治疗组比较，Sim早期治疗组ROS水平和NADPH氧化酶活性下降得更为显著。 (10) 在1μg/ml LPS作用下，体外培养的新生SD大鼠心肌细胞内TNF-α、IL-6和IL-10mRNA和蛋白表达水平明显增加，并具有时间依赖性，与对照组比较有显著性差异。 (11) 在1μg/ml LPS作用下，心肌细胞ROS水平和NADPH氧化酶活性明显升高，与对照组比较有非常显著性差异。心肌细胞ROS水平和NADPH氧化酶活性的升高在时间上早于炎性细胞因子的表达。给予NAC或NADPH氧化酶抑制剂二亚苯基碘鎓预处理后，心肌细胞TNF-α、IL-6蛋白表达水平较LPS组明显降低，而IL-10蛋白含量与LPS组无显著差异。 (12) 在20~500μmol/l外源性H2O2作用下，心肌细胞培养上清TNF-和IL-6蛋白含量与对照组比较均明显升高，有显著性差异。20~500 μmol/l H2O2对IL-10 蛋白含量无明显影响。 (13)给予0.1~10μmol/l Sim预处理后再给予LPS刺激，TNF-α、IL-6 mRNA和蛋白表达水平随着Sim浓度的增加逐步下降，其中1μmol/l和10 μmol/l Sim干预组表达水平与LPS组比较有非常显著性差异。而在1 μmol/l Sim的基础上同时给予0.1 mmol/l 甲羟戊酸预处理，TNF-α、IL-6 mRNA和蛋白表达水平与1μmol/l Sim+LPS组比较显著升高，而与LPS组比较无显著性差异。0.1~10 μmol/l Sim对LPS诱导的IL-10 mRNA和蛋白表达水平无明显影响。 (14) 在1 μmol/l Sim预处理后再给予100 μmol/lH2O2刺激，心肌细胞培养上清TNF-α和IL-6 蛋白含量与H2O2组比较无显著差异。 (15) 在1μg/ml LPS作用下，心肌细胞p38 MAPK 活性显著增强，并且在时间上早于炎性细胞因子的表达。NAC、DPI以及Sim预处理可明显抑制p38 MAPK活性，MVA可逆转Sim对p38 MAPK 活性的抑制作用。 (16) 在LPS作用的基础上给予p38 MAPK抑制剂SB203580 预处理后，心肌细胞培养上清TNF-α、IL-6 蛋白含量明显降低，与LPS组比较有非常显著性差异，而IL-10蛋白含量与LPS组比较无显著性差异。 研究结论: (1) 高血压可上调心肌组织促炎性细胞因子表达，虽然与心脏重构的启动无关，但参与了心脏重构的进一步发展，与间质重构和舒张性心脏功能衰竭相关。 (2) 高血压可上调心肌组织ROS水平，ROS介导的信号通路是心肌组织和心肌细胞内促炎性细胞因子表达的重要机制之一，p38 MAPK可能是该信号通路的一个重要下游分子。抗氧化剂可以通过下调促炎性细胞因子表达延缓高血压心脏重构的进程。 (3) Sim可在一定程度上延缓和逆转高血压心脏重构的发生，早期治疗效果可能优于晚期治疗。 (4) Sim抑制心肌组织和心肌细胞NADPH 氧化酶活性，降低ROS水平，部分阻断ROS信号通路，从而抑制促炎性细胞因子表达，可能是Sim延缓和逆转心脏重构的重要机制之一。 综上所述，不难看出高血压可上调促炎性细胞因子表达，促炎性细胞因子的表达可促进心脏重构的形成和发展；活性氧介导的信号通路至少部分参与了心肌组织和心肌细胞炎性细胞因子表达的信号传导机制；他汀类药物可通过抑制氧化应激和炎性细胞因子表达防治高血压心脏重构。由此可见，本项研究的结果有望为高血压心脏重构的防治提供新思路和理论依据。