肌肽与阿司匹林滴眼液联合滴眼对糖尿病大鼠眼组织的影响

摘要

世界卫生组织1995年统计，全世界因白内障致盲的患者约1700万，国内也有500万以上。白内障是我国乃至世界首位致盲性疾病，尽管手术治疗白内障的技术在不断完善，但不可避免的手术风险、严重的术后并发症以及由此而引起的经济问题等，仍难以解决与日俱增的白内障患者的需要，美国国立眼科研究所曾推算，如果能延缓10年白内障的发生，可减少50％白内障手术。因此，寻找有效的抗白内障药物具有重要的科学意义和社会效益。随着生活水平不断提高和人口老龄化，世界糖尿病患者日渐增多，糖尿病性白内障患者也在增加，所以研究糖尿病性白内障的发病机制和潜在的药物治疗方法，具有非常重要的价值。然而白内障的药物治疗仍然面临着严峻的挑战。90年代以来，有关防治STZ－糖尿病白内障药物的研究引人注目，但尚处于实验阶段。尽管近40多种抗白内障药物被广泛的临床使用，但证明其有效性的直接证据甚少，可能有效的药物治疗白内障的手段将是联合用药的方法。已证明肌肽具有抗衰老及防治年龄相关性疾病的作用且有抗白内障的作用；小剂量阿司匹林可用于控制血糖，也有报道用于糖尿病性白内障的治疗，且廉价方便，副作用少，有望达到预期的效果。我们前期的动物实验研究结果提示肌肽和阿司匹林滴眼液，对大鼠早期糖尿病性白内障有一定的抑制作用，因此，本实验将研究肌肽与阿司匹林联合是否有更明显的作用。
　　谷胱甘肽是普遍存在的含巯基的三肽，它在细胞生物化学中起到重要的作用。它的功能有清除自由基和其它活性物质，调节DNA和蛋白质的合成，信号转导，调节细胞周期、免疫应答和细胞因子，还调节许多其它的代谢途径。在晶状体、角膜、视网膜和其它眼组织中谷胱甘肽的含量会随着年龄、白内障、糖尿病、射线和一些药物的摄入等因素而有所改变。
　　另外，筛选防治糖尿病性白内障药物，国外研究者一般多选用STZ－糖尿病模型，因为它发病缓慢，观察时间较长，与人糖尿病性白内障形成有许多相似之处，目前是国内外研究糖尿病性白内障发病机制与药物防治较常选用的模型。
　　目的：
　　1.探讨肌肽与阿司匹林滴眼液联合使用对STZ诱导的糖尿病性白内障形成过程的作用。
　　2.探讨肌肽与阿司匹林滴眼液联合使用对糖尿病性大鼠晶状体、角膜及视网膜中巯基化合物（GSH和蛋白质）的变化的影响。
　　方法：102只大鼠晶状体经裂隙灯检查后，剔除任何有晶状体疾病者。随机抽取12只正常大鼠作为正常对照组，其它的接受1％STZ（65mm/kg）枸橼酸缓冲液（20mmol/L，pH4.5）腹腔注射。96小时后取尾血检测大鼠血糖，血糖大于14mmol/L的大鼠作为糖尿病大鼠。治疗组大鼠分为3组：C组接受1％肌肽磷酸钠缓冲液（25mmol/L，pH7.4）滴双眼，2/日；D组接受0.05％阿司匹林磷酸钠缓冲液（25mmol/L，pH7.4）滴双眼，2/日；E组接受1％肌肽磷酸钠缓冲液和0.05％阿司匹林磷酸钠缓冲液（25mmol/L，pH7.4）交替滴眼，双眼，各2/日。监测血糖、尿糖及体重的变化。通过裂隙灯观察并记录所有大鼠双眼晶状体形成白内障的过程。根据英国牛津大学眼科实验室方法将晶状体混浊度进行分级。第8周时将所有大鼠处死，分离出晶状体用于测定其水溶性蛋白质、巯基化合物（谷胱甘肽和蛋白质）的含量，和谷胱甘肽还原酶（GR）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）及过氧化氢酶（CAT）的活性；分离出角膜及视网膜用于测定其水溶性蛋白及巯基化合物（谷胱甘肽和蛋白质）的含量。
　　结果：约84.4％的大鼠接受STZ注射96小时后血糖>14mmol/L。糖尿病大鼠的血糖及尿糖明显高于对照组（P<0.05），而体重明显低于对照组（P<0.05）。糖尿病未治疗组大鼠成模后的第4周晶状体出现明显的混浊，混浊度等级以中位数表示为0（0～1）。糖尿病治疗组大鼠成模后第5周晶状体才出现明显的混浊，晶状体混浊度等级以中位数均为0（0～1）。在各组滴眼液治疗组大鼠和未治疗组大鼠之间，晶状体混浊程度前者出现和发展都明显低于后者（P<0.05），且在第8周时，联合治疗组晶状体的混浊程度明显比未治疗组和阿司匹林治疗组的低（P=0.002，E组VSB组；P=0.04，E组VSD组）。
　　在糖尿病未治疗组和正常对照组之间比较，大鼠晶状体中水溶性蛋白质含量[g/L，1.65±0.22VS2.10±0.14，(P<0.001)]及巯基化合物（GSH和蛋白质）含量[mg/gprot，89.64±18.63VS117.56±24.25，(P=0.002)]有显著统计学差异。糖尿病治疗组晶状体中水溶性蛋白的含量较未治疗组高，但均未有明显的统计学差异[g/L，C组：1.72±0.18VS1.65±0.22(P=0.35)，D组：1.74±0.10VS1.65±0.22(P=0.22)，E组：1.79±0.17VS1.65±0.22(P=0.08)；VSB组]；CAT的活性前者也都高于后者，而只有C组的活性与未治疗比较有统计学差异（P=0.046）。比较治疗组与未治疗组大鼠晶状体中巯基化合物的含量，前者都高于后者，但均未有明显的统计学差异[mg/gprot，C组：97.47±22.00VS89.64±18.63(P=0.34)，D组：91.93±7.14VS89.64±18.63(P=0.77)，E组：100.40±13.50VS89.64±18.63(P=0.27)；VSB组]。GR活性，治疗组也都高于未治疗组而低于正常对照组，但均未有明显统计学差异。GPx的活性，糖尿病组均高于正常对照组，且都存在统计学上的差异[U/gprot，C组：31.31±5.06VS17.28±5.19(P<0.001)；D组：34.38±4.64VS17.28±5.19(P<0.001)；E组：26.21±6.99VS17.28±5.19(P=0.001)]；同时，治疗组又低于未治疗组，也有明显的统计学差异[C组：31.31±5.06VS46.14±4.77(P<0.001)；D组：34.38±4.64VS46.14±4.77(P<0.001)；E组：26.21±6.99VS46.14±4.77(P<0.001)]；另外，E组的活性明显低于D组，有明显的统计学差异（P=0.001）。C组中水溶性蛋白质含量（g/L，C组：1.72±0.18，E组：1.79±0.17）和巯基化合物含量（mg/gprot，C组：97.47±22.00，E组：100.40±13.50）低于E组，而CAT、GR和GPx的活性C组均高于E组。
　　在视网膜中巯基化合物的含量，未治疗组低于正常对照组。同时，实验结果显示肌肽组与阿司匹林组均高于正常对照组，它们之间均存在明显的统计学差异（P<0.05），并且这两组与未治疗组之间也存在着统计学差异，且前者高于后者。然而，联合治疗组的含量却低于正常对照组，也低于未治疗组，但均未有统计学差异。
　　在角膜中，肌肽治疗组的巯基化合物含量与正常对照组相比是增加的，而其它各组的含量都是下降的，而且，在肌肽治疗组和未治疗组之间存在明显的统计学差异（P<0.05）。
　　结论：STZ腹腔注射建立的糖尿病性白内障大鼠模型，是研究糖尿病性白内障的理想模型。局部应用肌肽和阿司匹林滴眼液是安全和简便的，可以应用于筛选其他防治糖尿病性白内障药物研究中。糖尿病大鼠晶状体内巯基化合物（GSH和蛋白质）的含量，GR与CAT的活性明显降低，GPx活性增高。这为糖尿病性晶状体氧化应激学说提供了实验依据。在糖尿病早期，肌肽滴眼、阿司匹林滴眼及联合交替滴眼都明显的延缓了晶状体混浊度，联合滴眼治疗比单独使用阿司匹林治疗效果好，这种作用与抑制蛋白质氧化损伤有关。
　　本实验由于实验环境的影响，为了保持实验室的空气流通，导致室内温度相对较低，对于处于糖尿病时期的大鼠来说，造成了死亡率的增加。本实验测定的是巯基化合物的含量，虽然巯基化合物主要是谷胱甘肽和蛋白质，但是其中游离的谷胱甘肽的含量无法确定。如果能直接测得游离的还原型谷胱甘肽的含量，并采用药物代谢动力学方法分析肌肽与阿司匹林滴眼液联合交替使用的作用，这将更有利于阐明氧化损伤的作用机制。
　　创新点：首次采用了肌肽滴眼液与阿司匹林滴眼液联合交替的方法，研究其对糖尿病大鼠晶状体混浊的抑制作用及机制。首次观察肌肽滴眼液与阿司匹林滴眼液联合交替的方法对糖尿病大鼠角膜、视网膜组织中巯基化合物（谷胱甘肽和蛋白质）含量的影响。

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封面

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中文摘要

英文摘要

前言

文献回顾

1. 糖尿病性白内障的研究现状

2. 肌肽的研究现状

3. 阿司匹林的研究现状

正文

实验部分

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 实验讨论

小结

参考文献

附录

致谢