大肠杆菌对恩诺沙星抗药性突变规律研究

摘要

细菌对抗菌药物产生抗药性是兽医临床遇到的重要难题之一，检测临床分离细菌的抗药性对及时掌握细菌的抗药趋势有重要作用。研究大肠杆菌对喹诺酮抗药性突变规律，以及基因型与表型的对应关系，可以根据临床检测的抗药性表型判断和预测相应的基因突变。
　　 本文以药敏试验质控菌株EscherichiacoliATCC25922为初始菌株，建立氟喹诺酮最敏感的靶位蛋白祖先基因，用恒化连续培养、恩诺沙星递增浓度连续诱导培养及抗药性基因定点突变实验，获得一系列抗药性菌株，测定其对恩诺沙星的MIC值，并比较喹诺酮靶酶基因gyrA和parC的完整序列及其突变位点，分析了抗药性表型与基因型、蛋白结构、外排泵及生化特性的关系，以此为标尺对比了临床菌株的MIC。
　　 研究结果表明大肠杆菌对氟喹诺酮抗药性突变具有明显规律，低浓度喹诺酮并不能诱导高的抗药性突变;GyrA的Ser83-Leu位点单一的突变，进而增加ParC的Glu84-Lys，可导致低水平抗药性;而Ser83-Leu逐步与Asp87-Gly、Glu84-Lys组合，导致喹诺酮突变决定区突变位点氨基酸的极性、空间位阻变化影响靶蛋白与DNA和恩诺沙星的结合，造成4个明显的敏感性平台:0.125、0.5、2、8μg·mL-1，其中0.5μg·mL-1对应MIC=2μg·mL-1，即CLSI推荐的R值2μg·mL-1，当突变位点包含Ser83-Leu，Asp87-Gly和Glu84-Lys，而高于R值的菌株生化特性也发生了显著的改变，菌落黏度变大。
　　 利用定点突变实验技术依次将gyrA亚基中易突变位点83、81、84、87构建在同一个重组质粒载体上，转化大肠杆菌ATCC25922，结果当构建在表达载体菌株中突变位点依次增加时，对恩诺沙星的MIC累积提高。当将gyrA亚基易突变位点81、83、84、87最终构建在同一重组质粒表达载体中，最终的MIC值为64μg·mL-1，结果和递增浓度喹诺酮分步诱导大肠杆菌实验最高MIC值相近。通过基因型与表型的对应关系，判断1485株临床大肠杆菌分离频率最高的MIC=8-16μg·mL-1，其基因型仍然是Ser83-Leu、Asp87-Gly、Glu84-Lys，而MIC高于32μg·mL-1，外排泵与基因突变共同作用，使细菌耐受逐步升高的药物浓度，MIC基本平行地高出培养浓度的1倍。综合分析本研究所获得试验结果，表明增加恩诺沙星的使用剂量，能诱导高抗菌株产生，恩诺沙星抗药性表型与基因型具有对应关系和规律性变化，据此可以通过临床菌株的MIC判断抗药性突变基因型，预测下一步可能的突变;同时在新药研发中应加强外排泵抑制剂等的研究。

目录

声明

摘要

前言

第一章 文献综述

1 细菌抗药性研究历史

2 大肠杆菌的抗药性现状

3 喹诺酮类药物对大肠杆菌的作用机制

4 大肠杆菌对喹诺酮类药物抗药性机制

5 研究目的和意义

第二章 研究内容

试验一 低浓度思诺沙星恒定诱导大肠杆菌

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 小结

试验二 倍增浓度恩诺沙星分步诱导培养大肠杆菌抗药性

1 材料

2 方法

3 结果与分析

4 讨论

5 小结

试验三 大肠杆菌全酶亚基序列谱与三维蛋白结构对比分析

1 材料

2 方法

3 结果与分析

4 讨论

5 小结

试验四 大肠杆菌gyrA基因表达载体构建及其抗药性表型研究

1 材料

2 方法

3 结果与分析

4 讨论

5 小结

全文总结

参考文献

英文缩略词表

致谢

作者简介

在读期间科研成果