耐药基因mecA阻断策略逆转MRSA及MRSE耐药性的研究

摘要

目的：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和耐甲氧西林表皮葡萄球菌（MRSE）是医院内感染最常见、最重要的致病菌，对所有β-内酰胺类抗生素和其他多种抗菌药物耐药，因此由MRSA和MRSE引起的感染，治疗十分困难，病死率很高。近年来MRSA和MRSE的感染率逐年上升，特别是MRSA，其传播已经不止局限于医院内，社区获得性MRSA（CA-MRSA）的检出率日益增多，并且呈现广泛传播和扩大流行的趋势。CA-MRSA能够在健康人群中引起严重的甚至致命的感染，它的流行已经成为严重的公共健康问题，并引起了医学界的高度关注。目前治疗MRSA和MRSE最有效的药物是万古霉素，然而对万古霉素耐药的MRSA的出现，迫使人们必须寻找一种更有效的控制MRSA和MRSE感染的策略。MRSA和MRSE耐药性的产生主要是由于生成了由mecA编码的新的青霉素结合蛋白PBP2a。我们实验室前期的研究结果显示，阻断耐药基因mecA的上游调控基因mecR1的表达能够部分逆转MRSA的耐药性。但由于缺乏有效的递药系统；同时mecA的上游调控基因在临床菌株中容易发生突变或缺失，因此抗mecR1的PS-ODN对mecR1表达的抑制作用有限，而且只对部分携带完整SCCmec元件的临床菌株有效。基于以上问题，本研究中我们的目的有二：1.根据细菌细胞壁以及PS-ODN的特性，我们通过改良配方制备了新型的高效转染PS-ODN的脂质体；2.以SCCmec元件中的下游耐药基因mecA为靶基因，观察体内体外实验中PS-ODN能否完全恢复β-内酰胺类抗生素对MRSA和MRSE的抗菌活性。
　　方法：
　　1.新型高效包裹反义脱氧寡核苷酸的纳米微粒脂质体的制备：以mecAmRNA为靶基因设计合成硫代反义寡核苷酸；将25KD的PEI与PS-ODN通过静电相互作用制备成荷正电荷的纳米微粒，选用蛋黄卵磷脂（EPC）、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油（DMPG）和聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（PEG2000-DSPE）以薄膜分散法制备包裹PS-ODN/PEI纳米微粒的脂质体；用粒径分析仪测定纳米微粒和脂质体的平均粒径；用葡聚糖凝胶过滤法分离未被包封的PS-ODN/PEI纳米微粒和脂质体；紫外法测A260nm值计算脂质体的包封率；通过体外释放实验评估脂质体的稳定性。
　　2.脂质体包裹的抗mecAmRNA的PS-ODN010、PS-ODN853逆转MRSA耐药性的体内体外实验研究：以脂质体为载体将包裹的PS-ODN010或PS-ODN853转染到MRSA菌体内。通过平板克隆形成实验计数菌落数（CFU）并测定的MRSA生长曲线，观察给予PS-ODN010、PS-ODN853后苯唑西林对MRSA生长的影响；观察给予PS-ODN853后抗生素对MRSA的最小抑菌浓度（MIC）的变化；通过荧光实时定量PCR法检测PS-ODN853对靶基因mecA表达变化的影响；构建BALB/c小鼠的败血症模型，并观察给予PS-ODN853后，苯唑西林是否能够提高小鼠的存活率。在体外实验中包裹PS-ODN010或PS-ODN853的脂质体分别设0.7、2、6、18μM四个组，同时设PBS对照组、包裹PBS脂质体组、包裹随机对照链PS-ODN203（18μM）脂质体组、游离PEI（0.2μM）组、裸PS-ODN010或PS-ODN853（18μM）组。在动物实验中设生理盐水对照组、苯唑西林组、空白脂质体加苯唑西林组、裸PS-ODN853加苯唑西林组以及脂质体包裹PS-ODN853（2.5、5、10mg/kg）加苯唑西林组，上述分组中的苯唑西林给药量均为100mg/kg、2/日、连续7天，裸PS-ODN853为10mg/kg/日、连续3天，脂质体为1/日、连续3天。
　　3.脂质体包裹的抗mecAmRNA的PS-ODN853逆转MRSE耐药性的研究：用脂质体将包裹的PS-ODN853转染到MRSE菌体内。通过平板克隆形成实验计数CFU并测定MRSE的生长曲线，观察给予PS-ODN853后苯唑西林对MRSE生长的影响；观察给予PS-ODN853后抗生素对MRSE的最小抑菌浓度（MIC）的变化；通过荧光实时定量PCR法检测PS-ODN853对靶基因mecA表达变化的影响。实验中包裹PS-ODN853的脂质体分别设0.7、2、6、18μM四个组，同时设PBS对照组、包裹PBS脂质体组、包裹随机对照链PS-ODN203（18μM）脂质体组、游离PEI（0.2μM）组和裸PS-ODN853（18μM）组。
　　结果：
　　1.新型高效包裹反义脱氧寡核苷酸的纳米微粒脂质体的制备：PS-ODN/PEI纳米微粒和脂质体的粒径分别为（84.8±21.7）nm和（217.1±78.6）nm，脂质体的平均包封率为（79.7±2.69）％。稳定性分析结果显示，将脂质体混悬液放置于4℃和室温14d后，脂质体的载药量分别为初始载药量的76.32％和70.1％，但与4℃相比脂质体放置于室温时其载药量的变化波动较大。脂质体混悬液于37℃放置时，放置2d后脂质体的载药量仅为初始载药量的61.69％，约40％的PS-ODN渗漏到脂质体外，表明脂质体在体内37℃时有较好的释药率，能缓慢的将包裹的药物释放。
　　2.脂质体包裹的抗mecAmRNA的PS-ODN010、PS-ODN853逆转MRSA耐药性的体内体外实验研究：⑴与空白对照组相比，脂质体包裹PS-ODN010、PS-ODN853组的MRSA（WHO-2或MRSA071001）的菌落数均明显减少（P<0.01），而空白脂质体组、随机链对照组和游离PEI组的菌落数无显著性的减少（P>0.05），裸PS-ODN组MRSA的菌落数也明显减少（P<0.01），但与脂质体包裹PS-ODN组相比，脂质体包裹PS-ODN组的CFU减少的更加明显（P<0.01）。⑵与空白对照组相比，脂质体包裹PS-ODN010、PS-ODN853组苯唑西林明显的抑制了MRSA（WHO-2或MRSA071001）的生长，并且PS-ODN的浓度越大，苯唑西林的抑制作用越明显。而空白脂质体组、随机链对照组、游离PEI组和裸PS-ODN组MRSA的生长与空白对照组相比没有明显的差异。⑶给予18μM脂质体包裹的PS-ODN853后，苯唑西林等6种抗生素对WHO-2及5株MRSA临床菌株的MIC值均明显降低。⑷荧光实时定量PCR结果显示脂质体包裹的PS-ODN853能明显抑制基因mecAmRNA的表达，并具有浓度依赖性抑制效应。而随机对照链PS-ODN203对mecAmRNA的表达没有明显影响。⑸动物实验结果显示脂质体包裹的2.5、5、10mg/kgPS-ODN853治疗组小鼠的存活率分别为26.7％、46.7％和53.3％，而其它对照组的小鼠全部死亡；脂质体包裹的PS-ODN853治疗组的血液培养物中的菌落数明显少于对照组。
　　3.脂质体包裹的抗mecAmRNA的PS-ODN853逆转MRSE耐药性的研究：⑴与空白对照组相比，脂质体包裹PS-ODN853组的MRSE070901的菌落数明显减少（P<0.01），而空白脂质体组、随机链对照组和游离PEI组的菌落数无显著性的减少（P>0.05），裸PS-ODN853组MRSE的菌落数也明显减少（P<0.01），但与脂质体包裹PS-ODN853组相比，脂质体包裹PS-ODN853组的CFU减少的更加明显（P<0.01）。⑵与空白对照组相比，脂质体包裹的PS-ODN853组苯唑西林明显抑制了MRSE070901的生长，并且PS-ODN853的浓度越大，苯唑西林的抑制作用越明显。而空白脂质体组、随机链对照组、游离PEI组和裸PS-ODN853组MRSE070901的生长与空白对照组相比没有明显的差异。⑶给予18μM脂质体包裹的PS-ODN853后，苯唑西林等6种抗生素对MRSE070901的MIC值明显降低。⑷荧光实时定量PCR结果显示脂质体包裹的PS-ODN853能明显抑制基因mecAmRNA的表达，并具有浓度依赖性抑制效应，而随机对照链PS-ODN203对mecAmRNA的表达没有影响。
　　结论：
　　1.脂质体包裹的抗mecAmRNA的反义硫代脱氧寡核苷酸（PS-ODN853和PS-ODN010）能够选择性抑制MRSA标准菌株WHO-2及临床菌株的耐药基因mecA的表达，进而能够有效的逆转MRSA对β-内酰胺类抗生素的耐药性，恢复其敏感性；
　　2.我们首次在小鼠感染模型上观察到脂质体包裹的PS-ODN853能够恢复WHO-2对苯唑西林的敏感性，部分恢复了苯唑西林对WHO-2的杀菌作用，感染小鼠的存活率提高到53.3％。
　　3.脂质体包裹的抗mecAmRNA的反义硫代脱氧寡核苷酸（PS-ODN853）能够选择性抑制MRSE临床菌株耐药基因mecA的表达，从而能够有效的逆转MRSE对β-内酰胺类抗生素的耐药性，恢复其敏感性；
　　4.我们首次制备了新型的包裹PS-ODN/PEI纳米微粒的脂质体，该脂质体易于制备，包封率高，性质稳定。药效学实验证明了我们制备的新型脂质体能将其包裹的PS-ODN/PEI纳米微粒有效的转染入MRSA和MRSE菌体内，从而使PS-ODN能够有效的抑制靶基因mecA的表达，表明该新型脂质体可以作为转染PS-ODN进入细菌体内的有效载体；
　　5.以细菌的耐药基因为靶点，应用反义技术抑制其表达，从而逆转耐药细菌的耐药性，恢复对β-内酰胺类抗生素的敏感性，使失效的抗生素重新发挥其疗效，这种方法可能成为人们对抗耐药细菌的新策略。

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封面

声明

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缩略语表

中文摘要

英文摘要

文献回顾

一、细菌耐药性现状及治疗策略

二、反义寡核苷酸的研究现状

三、脂质体的研究现状

前言

正文

第一部分 新型高效包裹反义脱氧寡核苷酸的纳米微粒脂质体的制备

第二部分 纳米微粒脂质体包裹抗mecA反义寡核苷酸逆转MRSA耐药性的体外及体内实验研究

第三部分 纳米微粒脂质体包裹抗mecA反义寡核苷酸逆转MRSE耐药性的体外实验研究

结论

参考文献

个人简历和研究成果

致谢