通过阻断ICOS/B7h的供体B细胞预输注诱导心脏移植耐受的实验研究

摘要

【背景】
　　供体特异性输注（Donorspecifictransfusion，DST）泛指在围移植术期通过给予受体输注供体来源的全血、脾淋巴细胞或其他细胞成分，从而延长移植物存活的一种治疗手段，至今已有30多年的研究历史。新近的多项研究表明，通过DST协同共刺激阻断（包括CD28/B7和CD40/CD40L）的治疗，在啮齿类动物模型中成功诱导移植耐受。ICOS作为CD28超家族中的第三成员，其配体B7h组成表达于B细胞表面。ICOS/B7h信号在排斥反应中的重要作用已为学界所公认。静息状态的B细胞是一种良好的供体抗原输注成分，有研究表明缺失共刺激能力的B细胞具有良好的致耐受性（Tolerogenic）。因此我们设想通过重组的ICOSIg融合蛋白在体外与供体来源的B细胞预孵育，从而阻断其与受体T细胞间的ICOS/B7h信号，并利用这种方式的DST进行相关的体内、体外实验研究。
　　【方法】
　　1.体外实验，通过流式细胞术确定ICOSIg与B细胞结合的饱和浓度，通过单向混合淋巴细胞反应检测ICOSIg靶定的B细胞刺激反应性T细胞增殖的能力。
　　2.分别以BALB/c和C57BL/6小鼠为供、受体，建立小鼠颈部异位心脏移植模型，流式细胞术检测移植术后受体外周淋巴器官中ICOS的表达，对移植物进行组织病理学监测（包括HE、Masson、IHC染色）。
　　3.移植术前给予受体ICOSIg靶定的供体B细胞和/或ICOSIg预输注。对于移植物存活超过100d的受体，进行第三方供体皮片移植实验，鉴定耐受的供体特异性。
　　4.夹心ELISA法检测耐受鼠血清中Th1/Th2类细胞因子的浓度。
　　5.RT-PCR法检测长期存活的移植物内Th1/Th2类细胞因子mRNA的水平。
　　6.流式细胞术检测耐受鼠外周血中CD4+CD25+T细胞的亚群比例，检测移植术后7d受体引流淋巴结内T细胞的凋亡情况。
　　7.通过磁珠分离法获取耐受鼠脾脏来源的不同细胞亚群，分别将其过继性转移给经300rad60Co预照射的正常受体，24hr后给予同品系供体来源之心脏移植，观察转移性耐受的形成与否。
　　【结果】
　　1.重组ICOSIg融合蛋白与小鼠脾淋巴细胞能够良好结合，其饱和浓度在100μg/ml左右。
　　2.在体外，ICOSIg靶定的B细胞无法刺激反应性T细胞的正常增殖；受体APCs呈递的ICOS/B7h信号可以部分恢复反应性T细胞的增殖活性；比较而言，直接识别途径的ICOS/B7h信号似乎对于T细胞的增殖作用更为显著。
　　3.成功建立小鼠颈部异位心脏移植模型。通过ICOSIg靶定的供体B细胞预输注（ITBT）可以显著延长移植心在受者体内的存活，当且仅当ITBT和ICOSIg联合预处理后，75％的移植物存活超过100天。诱导获得之耐受具有供体特异性。
　　4.耐受鼠的外周淋巴器官及移植物中均有不同程度的ICOS+细胞亚群存在，其外周血中CD4+CD25+T细胞的亚群比例显著高于对照组（15.6±5.69％，P＜0.01）。
　　5.与对照相比，ITBT+ICOSIg预处理的受体移植术后7d，其引流淋巴结中CD8+T细胞凋亡比例显著高于对照组（19.53±5.10％，P＜0.05）。
　　6.与正常对照相比，未处理组受体移植术后7d，血清中IFN-γ水平显著提高（600.2±400.0pg/mlVS172.6±70.7pg/ml，P＜0.05），而耐受鼠血清中IL-10水平则显著低于正常对照（563.5±153.7pg/mlVS2063.3±367.9pg/ml，P＜0.005）.
　　7.与未处理组移植后7d的移植物相比，耐受鼠移植物内IL-2在mRNA水平低表达（IL-2Ratio：0.344±0.021，P＜0.05），而IL-10表达水平上调，（IL-10Ratio：0.910±0.038，P＜0.05）。
　　8.在过继性转移实验中证实，经＞10×106TSCs预输注，可诱导300rad60Co预照射的正常受体产生转移性耐受，进一步分群发现介导转移性耐受产生的调节性细胞主要集中于CD4+T细胞亚群内，然而相同剂量的CD4+CD25-TSCs（5×106）预输注则无法介导转移性耐受产生。
　　9.去除移植物后1个月，“耐受鼠”脾细胞介导转移性耐受的效率降低。
　　【结论】
　　1.体外实验结果显示，ICOSIg靶定的供体B细胞无法有效地刺激受体反应性，这表明直接识别途径中的ICOS/B7h信号，对于T细胞的正常增殖是不可或缺的。同时我们注意到，虽然通过间接识别途径呈递的该信号也可促进T细胞增殖，但与直接途径相比，其作用似乎较弱。
　　2.体内实验中，我们通过ICOSIg靶定的供体B细胞和ICOSIg的同时输注，成功诱导了MHC完全不匹配小鼠的供体特异性心脏移植耐受。
　　3.耐受的诱导及维持是一个动态调节的过程。通过预输注，我们在移植后7d受体的引流淋巴结内，找到了CD8+T细胞凋亡的证据。然而关于耐受的维持，无论是在外周血（CD4+CD25+T细胞比例），在移植物（Th1/Th2类细胞因子的mRNA水平），还是在耐受鼠的脾脏（转移性耐受），更多的证据偏向于调节机制。数据显示，耐受鼠脾脏中的CD4+CD25+T细胞亚群对于转移性耐受的介导是至关重要的。
　　4.同时我们发现移植物的存活本身对于维持Treg的克隆的大小也具有重要意义。
　　以上结果可为临床诱导移植耐受的实践提供一些思路和参考。

目录

封面

声明

目录

缩略语表

中文摘要

英文摘要

文献回顾

移植免疫耐受的研究现状

移植耐受动物模型的选择

前言

正文

第一部分 重组 ICOSIg 融合蛋白的体外功能鉴定

第三部分 心脏移植耐受形成及维持机制的初步探讨

小结

参考文献

附录

个人简历和研究成果

致谢