由凋亡供体白细胞诱导的移植耐受性的生物标志物

摘要

在某些实施方案中，本发明提供了鉴定和治疗具有由在瞬时免疫疗法的掩护下输注的凋亡供体白细胞诱导的移植耐受性的移植受体患者的方法。

说明书

相关申请

本申请要求2019年4月16日提交的美国临时申请号62/834,798的优先权。以上引用的申请的全部内容以引用的方式整体并入本文。

关于联邦资助的研究的声明

本发明是在美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的AI102463的政府支持下完成的。政府在本发明中具有一定权利。

发明背景

对于许多终末期器官衰竭患者来说，移植已成为最有效的治疗选择。目前的免疫抑制方案有效预防急性排斥反应；然而，其高发病率和其在预防慢性排斥反应方面缺乏功效仍然是严重的问题。越来越多的慢性免疫抑制移植受体群体继续与所述问题作斗争，这对其存活产生了不利影响。诱导对同种异体移植物的耐受性将消除维持免疫疗法的需要并提高同种异体移植物的长期存活率；然而，尽管所述诱导在65多年前首次在小动物模型中得到证实并具有临床显著性，但通过需要广泛调理疗法的混合造血嵌合体，仅在极少数患者中实现了耐受性。同样，在猴子的转化模型中，只有混合嵌合体几乎始终诱导对相同供体肾同种异体移植物的耐受性。

在非人类灵长类动物研究中，凋亡供体白细胞方案始终有效，并且需要强度小得多的短期免疫疗法。由于此方案的功效和非常有利的安全特性，此方案为第一个临床可转化的非嵌合移植耐受性方案。需要一种用于监测人类受体的移植物耐受性的诱导、维持和丧失的生物标志物。

发明概述

本发明鉴定了用于监测人类受体对实体器官、组织和细胞同种异体移植物的耐受性的诱导、维持和丧失的生物标志物。

在某些实施方案中，本发明提供了一种鉴定具有由在瞬时免疫疗法的掩护下施用的供体抗原诱导的移植耐受性的移植受体患者的方法，其包括：(a)测定来自患者的第一血液样品以检测靶细胞的基线频率，其中第一血液样品在瞬时免疫疗法的耐受前、移植前和起始前获得，(b)测定来自患者的第二血液样品以检测靶细胞的术后频率，其中第二样品在瞬时免疫疗法的耐受后、移植后和起始后获得；和(c)当术后频率比基线频率高至少2倍时，将患者鉴定为具有由供体抗原诱导的移植耐受性/免疫接受性，其中靶细胞是具有标志物CD49b+、LAG-3+、CD4+的T调节1型(Tr1)细胞。在某些实施方案中，具有由在瞬时免疫疗法的掩护下施用的供体抗原诱导的移植耐受性的移植受体患者维持移植耐受性。在某些实施方案中，供体抗原是凋亡供体白细胞(ADL)、与供体肽缀合或包封供体肽的供体特异性输血(DST)纳米粒子和/或与供体肽缀合的凋亡受体白细胞。在某些实施方案中，靶细胞是具有标记物CD49b+、LAG-3+、CD4+的T调节1型(Tr1)细胞，具有对至少一种错配的供体MHC I类肽的间接特异性，具有指示抗原特异性信号传导的转录组学特征，并具有指示激活状态的转录组学特征。

在某些实施方案中，移植受体患者维持移植耐受性。在某些实施方案中，移植受体患者诱导免疫耐受性但失败。在某些实施方案中，移植受体患者未诱导免疫耐受性。

在某些实施方案中，本发明提供了一种方法，其包括：(a)获得来自移植受体患者的第一血液样品以检测靶细胞的基线频率，其中第一血液样品在瞬时免疫疗法的耐受前、移植前和起始前获得，(b)获得来自患者的第二血液样品以检测靶细胞的术后频率，其中第二样品在瞬时免疫疗法的耐受后、移植后和起始后获得，(c)测定第一和第二血液样品以检测耐受前和耐受后的靶细胞水平，(d)当术后频率比基线频率高至少2倍时，将移植受体患者鉴定为具有由在瞬时免疫疗法的掩护下输注的供体抗原诱导的移植耐受性/免疫接受性，其中靶细胞是具有标志物CD49b+、LAG-3+、CD4+的T调节1型(Tr1)细胞。在某些实施方案中，供体抗原是凋亡供体白细胞(ADL)、与供体肽缀合或包封供体肽的供体特异性输血(DST)纳米粒子和/或与供体肽缀合的凋亡受体白细胞。在某些实施方案中，靶细胞是具有标记物CD49b+、LAG-3+、CD4+的T调节1型(Tr1)细胞，具有对至少一种错配的供体MHC I类肽的间接特异性，具有指示抗原特异性信号传导的转录组学特征，并具有指示激活状态的转录组学特征。

在某些实施方案中，移植受体患者维持移植耐受性。在某些实施方案中，移植受体患者诱导免疫耐受性但失败。在某些实施方案中，移植受体患者未诱导免疫耐受性。

在某些实施方案中，本发明提供了一种鉴定具有由在瞬时免疫疗法的掩护下的凋亡供体白细胞的围移植输注(即，在移植前后输注；在移植前几天进行至少一次输注)诱导的移植耐受性的移植受体患者的方法，其包括：(a)测定来自患者的第一血液样品以检测靶细胞的基线频率，其中第一血液样品在瞬时免疫疗法的耐受前、移植前和起始前获得，(b)测定来自患者的第二血液样品以检测靶细胞的术后频率，其中第二样品在瞬时免疫疗法的耐受后、移植后和起始后获得；和(c)当术后频率比基线频率高至少2倍时，将患者鉴定为具有由凋亡供体白细胞诱导的移植耐受性/免疫接受性，其中靶细胞是定义为CD49b

如本文所用，术语“在瞬时免疫疗法的掩护下”意指受体瞬时接受免疫疗法药剂，例如直接靶向除其它细胞以外的抗原呈递细胞和其对供体反应性T细胞、任何表达CD40的细胞以及T细胞和B细胞的激活的免疫抑制药物。如本文所用，“瞬时”意指疗法的效果仅持续短时间，例如几天(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天)，或几个星期(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12周)，或几个月(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月)。如本文所用，“免疫抑制”意指免疫响应的部分或完全抑制，其中与身体未接受免疫抑制药物时相比，身体的免疫系统被有意停止工作，或变得不太有效。在某些实施方案中，免疫疗法还包括抗炎疗法的瞬时施用。

在某些实施方案中，本发明提供了一种方法，其包括：(a)获得来自移植受体患者的第一血液样品以检测靶细胞的基线频率，其中第一血液样品在瞬时免疫疗法的耐受前、移植前和起始前获得，(b)获得来自患者的第二血液样品以检测靶细胞的术后频率，其中第二样品在瞬时免疫疗法的耐受后、移植后和起始后获得，(c)测定第一和第二血液样品以检测耐受前和耐受后的靶细胞水平，(d)当术后频率比基线频率高至少2倍时，将患者鉴定为具有由凋亡供体白细胞诱导的移植耐受性/免疫接受性，其中靶细胞是定义为CD49b

在某些实施方案中，本发明提供一种治疗移植受体的方法，所述方法包括：(a)使用上述方法鉴定具有由在瞬时免疫疗法的掩护下输注的凋亡供体白细胞(ADL)诱导的移植耐受性/免疫接受性的移植受体患者，和(b)通过停止施用免疫抑制剂来治疗移植受体患者。

附图简述

图1A。Tr1细胞的流动门控策略。(a)Tr1细胞(门控于CD3

图1B。四聚体染色的流动门控策略。流动门控策略显示了四聚体

图1C。Tr1细胞的转录谱。左图：在终止时获得的PBL中的XBP1、SUMO2和SH2D2的转录水平呈现为散点图。右图：群组B和C受体在终止时获得的PBL中的NDUFS4和NDUFS5的相对表达谱呈现为散点图。

图2。耐受动物的Tr1细胞的频率增加。ADL输注增加了具有调节表型的免疫细胞的频率和功能。群组B(n＝7，圆圈)和群组C(n＝5，方形)猴子中具有调节表型的循环细胞的相对数量。终止时PBL、LMNC和LN中的Tr1细胞。

图3。耐受动物的Tr1细胞的耗竭会恢复供体特异性增殖。在移植后12个月收集的群组C(n＝3)的PBL中的Tr1、Treg和Breg细胞的耗竭恢复了CFSE-MLR的CD4

图4。在Tr1细胞中通过siRNA沉默SH2D2a消除了对供体特异性增殖的抑制。Tr1细胞中的SH2D2的RNA沉默使其抑制能力丧失。与仅供体处理的受体PBL相比，没有Tr1细胞、Tr1细胞+载体和用靶向SH2D2转录分子的siRNA处理的Tr1细胞的情况下，CD4

图5。四聚体染色的流动门控策略。耐受动物的四聚体

图6A-6B。加入瞬时免疫抑制的ADL输注促进猴子的胰岛同种异体移植物的稳定耐受。(图6A)免疫疗法方案，包括群组B组和C猴子的治疗产品、剂量、途径和时间线。sTNFR，可溶性肿瘤坏死因子受体(依那西普)；抗IL-6R，抗IL-6受体(托珠单抗)；IE，胰岛等效物。(图6B)经组织学证实的无排斥反应的胰岛同种异体移植物存活率的Kaplan-Meir估计显示，与群组B(无ADL；n＝7；虚线；P＝0.021，Mantel-Cox)相比，群组C(ADL；n＝5；实线)具有优越的持续同种异体移植物存活率。

图7。在基线移植前对供体抗原敏感的受体中，缺乏耐受性生物标志物与移植的移植物功能的早期丧失相关。通过流式细胞术分析外周循环(ADL+TIS前和移植后)中的Tr1细胞的频率。移植前对供体抗原敏感的受体的ADL输注和TIS导致移植后第14天Tr1细胞的频率显著降低，而不是增加。截至移植后第28天，循环Tr1细胞的频率达到了相同受体的初始状态下观察到的水平，所述相同受体的移植前血清显示在基线时对供体抗原敏感的证据。对这些受体的Tr1细胞的监测(即使没有专门监测对错配的供体MHC I类肽具有间接特异性且具有高度明确的转录组学谱的Tr1细胞)强烈表明ADL输注和TIS未能在这些受体中诱导对供体同种异体抗原的免疫耐受。

图8。耐受性生物标志物的丧失先于移植的移植物功能的丧失。通过流式细胞术分析外周循环(ADL+TIS前和移植后)中的Tr1细胞的频率。ADL输注和TIS导致移植后早期Tr1细胞的频率显著增加。Tr1细胞的循环频率在移植后第180天开始下降，并在第300天达到初始状态下观察到的水平，表明耐受性生物标志物的丧失先于移植物功能的丧失。

具体实施方式

用凋亡供体白细胞(ADL)进行阴性疫苗接种代表了一种有前景的非嵌合策略，用于在移植中诱导供体抗原特异性耐受性。用化学交联剂乙基碳二亚胺(ECDI)离体处理的白细胞在静脉内输注后经历了快速凋亡。在鼠类同种异体移植模型中，在第-7天和第+1天(相对于第0天移植)静脉内输注ECDI处理的凋亡供体脾细胞会诱导对次要抗原错配的皮肤移植物、对完全主要组织相容性复合体(MHC)错配的胰岛同种异体移植物以及当与短期雷帕霉素组合时，对心脏同种异体移植物产生强大且特异于同种异体抗原的耐受性。大多数供体ECDI处理的脾细胞被脾边缘区抗原呈递细胞(APC)迅速内化，APC在吸收凋亡小体后的成熟被阻止，导致选择性上调的阴性而非阳性共刺激分子。

遇到受体APC后，具有间接同种异体特异性的T细胞的数量迅速增加，随后发生深度克隆收缩；剩余的T细胞被隔离在脾脏中，没有转移到同种异体移植物或同种异体移植物引流淋巴结。残余供体ECDI处理的未被宿主吞噬细胞内化的脾细胞弱激活具有直接同种异体特异性的T细胞，使它们对随后的刺激产生抵抗(无反应)。ECDI处理的脾细胞也激活并增加了调节T(Treg)和髓源性抑制细胞(MDSC)的数量。因此，在鼠类同种异体移植模型中，通过ECDI处理的脾细胞递送同种异体抗原而诱导的移植物保护机制涉及具有直接特异性的抗供体CD4+T细胞的克隆无反应性、具有间接特异性的抗供体CD4+T细胞的克隆耗竭以及由CD4+Treg细胞和MDSC进行的调节。

在自身免疫和过敏的鼠类模型中，将与ECDI交联的抗原静脉内注射到同源白细胞表面恢复了抗原特异性耐受性。重要的是，该策略既阻止了初始T细胞的引发，又有效控制了现有记忆/效应CD4+和CD8+T细胞的响应。一项涉及多发性硬化症患者的临床试验证实了ECDI偶联到自体白细胞后静脉内递送致脑炎肽的安全性，也产生了初步疗效证据。

在本研究中，显著扩展对鼠类同种异体移植物的ECDI处理的供体脾细胞的发现，我们证明了在瞬时免疫抑制下给予2次ADL输注的恒河猴(称为猴子)对胰岛同种异体移植物的稳定耐受性。我们发现，在我们的模型中，持久耐受性与供体特异性T和B细胞克隆的耗竭有关，最突出的是在1个MHC II类(MHC-II)等位基因匹配的ADL和同种异体移植物的受体中，有效和持续的调节。几个免疫细胞亚群，包括抗原特异性Tr1细胞，参与免疫调节，抑制供体反应性T细胞的移植后扩增和其向同种异体移植物的募集。

ADL诱导的移植耐受性与调节性免疫细胞亚群，包括具有不同特异性和转录组学特征的Tr1细胞的持续增加有关，从而鉴定一种生物标志物，用于监测由在瞬时免疫抑制的掩护下静脉内输注的ADL诱导的调节耐受性的诱导、维持和丧失。对至少1个错配的供体MHCI类肽表现出间接特异性的循环CD4

在某些实施方案中，本发明提供了一种鉴定具有由在瞬时免疫疗法的掩护下的凋亡供体白细胞的围移植输注诱导的移植耐受性的移植受体患者的方法，其包括：一种鉴定具有由在瞬时免疫疗法的掩护下的凋亡供体白细胞的围移植输注诱导的移植耐受性的移植受体患者的方法，其包括(a)测定来自患者的第一血液样品以检测靶细胞的基线频率，其中第一血液样品在瞬时免疫疗法的耐受前、移植前和起始前获得，(b)测定来自患者的第二血液样品以检测靶细胞的术后频率，其中第二样品在瞬时免疫疗法的耐受后、移植后和起始后获得；和(c)当术后频率比基线频率高至少2倍时，将患者鉴定为具有由凋亡供体白细胞诱导的移植耐受性/免疫接受性，其中靶细胞是定义为CD49b

在某些实施方案中，本发明提供了一种方法，其包括：(a)获得来自移患者的第一血液样品以检测靶细胞的基线频率，其中第一血液样品在瞬时免疫疗法的耐受前、移植前和起始前获得，(b)获得来自患者的第二血液样品以检测靶细胞的术后频率，其中第二样品在瞬时免疫疗法的耐受后、移植后和起始后获得，(c)测定第一和第二血液样品以检测耐受前和耐受后的靶细胞水平，(d)当术后频率比基线频率高至少2倍时，将患者鉴定为具有由凋亡供体白细胞诱导的移植耐受性/免疫接受性，其中靶细胞是定义为CD49b

在某些实施方案中，本发明提供一种治疗移植受体患者的方法，所述方法包括：(a)如本文所述地鉴定移植受体患者，和(b)通过停止施用免疫抑制剂来治疗移植受体患者。

确定移植受体患者是否获得并维持对移植物的免疫耐受性很重要。在某些实施方案中，患者接受的移植将是同种异体移植。如本文所用，术语“同种异体移植”被定义为将细胞、组织或器官从相同物种的遗传上不同的(即，相异的)供体移植到受体。移植可称为同种异体移植(allograft)、同种异体移植(allogeneic transplant)或同种移植。在某些实施方案中，同种异体移植是实体器官同种异体移植，例如肾、胰腺、肝、肠、心脏、肺或子宫移植。在某些实施方案中，同种异体移植是组织同种异体移植，包括但不限于脂肪组织、羊膜组织、绒毛膜组织、结缔组织、硬脑膜、面部组织、胃肠组织、腺体组织、肝组织、肌肉组织、神经组织、眼组织、胰腺组织、心包、骨骼组织、皮肤组织、泌尿生殖组织和血管组织。在某些实施方案中，同种异体移植是细胞同种异体移植，例如胰岛、肝细胞、成肌细胞、胚胎干细胞衍生的分化细胞移植(例如胰岛或胰岛β细胞或肝细胞移植)，或诱导多能干细胞衍生的分化细胞移植(例如胰岛或胰岛β细胞移植)、造血干细胞移植或骨髓移植。

如本文所用，“免疫接受性”、“免疫耐受性(immune tolerance)”、“免疫耐受性(immunological tolerance)”或“免疫耐受性(immunotolerance)”是免疫系统对能够在给定生物体中引发免疫响应的物质或组织无响应的状态。术语“移植耐受性”是免疫耐受性的一种形式。“移植耐受性”是在没有维持免疫抑制疗法的情况下同种异体移植物的长期存活率。此定义暗示，器官移植的耐受性受体对供体抗原无响应，但对其它(第三方)抗原维持反应性。成功脱离免疫抑制并维持稳定移植物功能1年或更长时间的器官移植受体被称为功能耐受或操作耐受。

免疫疗法

在某些情况下，移植受体患者将在移植之前、与其同时或在其之后接受免疫疗法，以诱导移植耐受性，其中免疫疗法是施用凋亡供体白细胞(ADL)。

在某些实施方案中，患者在移植之前、与其同时或在其之后接受免疫疗法。在某些实施方案中，凋亡供体白细胞可与一种或多种免疫调节分子一起施用，或另外施用一种或多种免疫调节分子，例如拮抗性抗CD40 mAb抗体、Fc工程化抗CD40L抗体、干扰CD40:CD40L共刺激的肽、mTOR抑制剂(例如西罗莫司(sirolimus)、依维莫司(everolimus))和瞬时抗炎疗法，包括坎普他汀(compstatin)(例如坎普他汀衍生物APL-2)、细胞因子拮抗剂(例如抗IL-6受体mAb(托西珠单抗(tozilizumab))、抗IL-6抗体(沙利鲁单抗(sarilumab)、奥洛珠单抗(olokizumab))、可溶性TNF受体(依那西普(etanercept))、抗TNF-α抗体(例如，英夫利昔单抗(infliximab)(Remicade)、阿达木单抗(adalimumab)(Humira))、α1-抗胰蛋白酶、核因子-κB抑制剂(例如，去羟甲基环氧喹霉素(DHMEQ))、ATG(抗胸腺细胞球蛋白)和其他多克隆T细胞耗竭抗体、阿仑单抗(alemtuzumab)(Campath)、抗IL-2R Abs(巴利昔单抗(basiliximab))、B细胞靶向策略(例如B细胞耗竭生物制剂，例如靶向CD20、CD19或CD22的生物制剂，和/或B细胞调节生物制剂，例如靶向BLyS、BAFF、BAFF/APRIL、CD40、IgG4、ICOS、IL-21、B7RP1的生物制剂)、霉酚酸酯、霉酚酸、下调鞘氨醇-1磷酸受体的下调剂(例如FTY720)、JAK抑制剂(例如托法替尼(tofacitinib))、免疫球蛋白(例如IVIg)、CTLA4-Ig(阿巴西普(Abatacept)/奥伦西亚(Orencia))、贝拉西普(belatacept)(LEA29Y、Nulojix)、他克莫司(tacrolimus)(Prograf)、环孢素A、来氟米特(leflunomide)、抗CXCR3抗体、抗ICOS抗体、抗OX40抗体和抗CD122抗体、脱氧精胍菌素、可溶性补体受体1、眼镜蛇毒因子、补体抑制剂(例如C1抑制剂、坎普他汀(compstatin))、抗C5抗体(依库珠单抗(eculizumab)/Soliris)、甲泼尼龙(methylprednisolone)、硫唑嘌呤。B细胞靶向生物制剂的非限制性实例包括利妥昔单抗(Rituximab)和抗CD20抗体。

在某些实施方案中，瞬时免疫疗法包含至少一种免疫抑制剂。在某些实施方案中，免疫抑制剂是CD40:CD40L共刺激抑制剂、mTOR抑制剂和靶向促炎性细胞因子的伴随抗炎疗法。在某些实施方案中，CD40:CD40L共刺激抑制剂是拮抗性抗CD40抗体、Fc工程化(失能、沉默)或Fab'抗CD40L抗体，或干扰CD40:CD40L共刺激的肽。在某些实施方案中，CD40:CD40L共刺激抑制剂是拮抗性抗CD40 mAb2C10R4。在某些实施方案中，至少一种免疫抑制剂是雷帕霉素。在某些实施方案中，第二药剂是抗炎剂。在某些实施方案中，抗炎剂是抗IL-6R(托珠单抗)和/或sTNFR(依那西普)。

在某些实施方案中，相对于第0天移植，为了通过在第-7天和第+1天输注凋亡供体白细胞来防止免疫系统的激活和抗供体免疫的诱导，用直接靶向除其它细胞以外的抗原呈递细胞和其对供体反应性T细胞、其他表达CD40的细胞或T细胞和B细胞的激活的药物对受体进行瞬时免疫抑制。制备和施用凋亡供体白细胞的方法是本领域已知的。Luo X,Pothoven KL,McCarthy D,DeGutes M,Martin A,Getts DR,Xia G,He J,Zhang X,KaufmanDB,Miller SD,ECDI-fixed allogeneic splenocytes induce donor-specifictolerance for long-term survival of islet transplants via two distinctmechanisms.Proc Natl Acad Sci U S A.2008年9月23日；105(38):14527-32；Miller等美国专利No.8,734,786。相对于第0天移植，在第-8或-7天给予每种免疫抑制剂的第一剂量。在第-8、-1、7和14天以50mg kg

在某些实施方案中，在移植前七至十四天(例如，-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8、-9、-10、-11、-12、-13、-14天)向患者施用免疫抑制剂的第一剂量。在某些实施方案中，在移植后几天(例如，第+1、+2、+3、+4、+5、+6、+7、+8、+9、+10、+11、+12、+13、+14、+15、+16、+17、+18、+19+或+20天)向移植受体患者施用免疫抑制剂的第二剂量。在某些实施方案中，在几天至几个月的治疗期的跨度内向移植受体施用免疫抑制剂的多个剂量(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10个剂量)。

疗法可以通过选择的施用途径施用。疗法可以通过输注或注射静脉内、腹膜内或肌肉内施用。

靶细胞

在本发明的某些实施方案中，在免疫疗法和移植之前(“耐受前”)从患者获得第一(基线)生物样品，例如血液样品。在某些实施方案中，在第-7天患者接受凋亡供体细胞的输注，在第0天移植受体患者接受移植物，并且在第+1天移植受体患者接受凋亡供体细胞的第二次输注。在移植之后(“移植后”)获得第二生物样品，且在第二次输注凋亡供体细胞之后获得第三样品。在某些实施方案中，在第一次细胞输注和移植之后获得第四生物样品。从这些样品中分离出非常特异的靶细胞，即被鉴定为T调节1型(Tr1)细胞的细胞，定义为CD49b

主要组织相容性复合体(MHC)II类四聚体染色能够对确定的抗原特异性CD4

本领域已知使用流式细胞术和门控来鉴定为CD49b

接下来，分析特定靶细胞，即为CD49b

使用免疫表位数据库分析资源鉴定了来自Mamu MHC I类和II类序列的对HLADRB1*13或HLA DRB1*14具有高结合亲和力的肽(表1)。

表1.与MHC II类分子结合的MHC I类肽。

还分析了特定靶细胞以确定其指示抗原特异性信号传导的转录组学特征。如本文所用，细胞的“转录组特征”是细胞群中的RNA的表达水平。简而言之，通过使用定量实时PCR，使用一组引物和探针分析来自分选的靶细胞的RNA，所述引物和探针通过对来自具有记录和稳定耐受性的移植受体的细胞的先前无偏RNAseq分析来选择和定义。在本发明的某些实施方案中，对从流式分选的Tr1细胞获得的RNA进行定量实时PCR。在某些实施方案中，指示抗原特异性信号传导的转录组学特征是含有SH2结构域的2A(SH2D2a)。

表2.Tr1细胞中差异表达的转录物。

在某些实施方案中，转录组学特征指示激活状态。在某些实施方案中，指示激活状态的转录组学特征是线粒体呼吸相关转录物NADH:泛醌氧化还原酶亚基S4(NDUFS4)。

移植

在某些实施方案中，移植是同种异体移植。在某些实施方案中，同种异体移植是实体器官同种异体移植。在某些实施方案中，同种异体移植是实体器官同种异体移植，例如肾、胰腺、肝、肠、心脏、肺或子宫移植。在某些实施方案中，实体器官同种异体移植是肾移植。在某些实施方案中，同种异体移植是组织同种异体移植，包括但不限于脂肪组织、羊膜组织、绒毛膜组织、结缔组织、硬脑膜、面部组织、胃肠组织、腺体组织、肝组织、肌肉组织、神经组织、眼组织、胰腺组织、心包、骨骼组织、皮肤组织、泌尿生殖组织和血管组织。在某些实施方案中，同种异体移植是细胞同种异体移植，例如胰岛、肝细胞、成肌细胞、胚胎干细胞衍生的分化细胞移植(例如胰岛或胰岛β细胞或肝细胞移植)，或诱导多能干细胞衍生的分化细胞移植(例如胰岛或胰岛β细胞移植)、造血干细胞移植或骨髓移植。

在某些实施方案中，移植是活体供体移植。在某些实施方案中，同种异体移植是细胞移植。

测定方法

在某些实施方案中，本发明涉及以下步骤：(a)测定来自移植受体患者的第一血液样品以检测靶细胞的基线频率，其中第一血液样品在瞬时免疫疗法的耐受前、移植前和起始前获得，(b)测定来自患者的第二血液样品以检测靶细胞的术后频率，其中第二样品在瞬时免疫疗法的耐受后、移植后和起始后获得，以及(c)当术后频率比基线频率高至少2倍时，将患者鉴定为具有由凋亡供体白细胞诱导的移植耐受性/免疫接受性，其中靶细胞是定义为CD49b

在某些实施方案中，将第一(基线)样品的靶细胞的频率与第二(术后)样品和后续样品的靶细胞频率进行比较。在某些实施方案中，频率增加至少2倍的测定指示由凋亡供体白细胞的围移植输注诱导的耐受性/免疫接受性。在某些实施方案中，频率增加至少3倍的测定指示由凋亡供体白细胞的围移植输注诱导的耐受性/免疫接受性。在某些实施例中，第一和第二样品之间的频率至少增加2倍、至少增加3倍、至少增加4倍、至少增加5倍、至少增加10倍、至少增加20倍、至少增加增加30倍、至少增加50倍、至少增加60倍、至少增加70倍、至少增加80倍、至少增加90倍、至少增加100倍或更多倍。

在某些实施方案中，靶细胞的频率由多参数流式细胞术确定。在某些实施方案中，靶细胞的频率由CyTOF质谱细胞术确定。

在某些实施方案中，移植受体患者已接受两次凋亡供体白细胞的围移植、静脉内输注。

在某些实施方案中，来自移植受体患者的外周血单核细胞用荧光缀合抗体和标志物(抗CD4、抗CD49b、抗LAG3、装载有错配的供体MHC I类肽的MHC II类四聚体)的定义的混合液染色，以促进使用微流体技术对标记细胞进行分类，并使用定量实时PCR使用耐受性相关转录物的后续定量来表征标记细胞。

这种定义的CD4

本发明现将通过以下非限制性实施例加以说明。

实施例1

几十年来，人们一直在追求移植耐受性作为临床相关目标。在本研究中，证明在短期免疫疗法下进行2次围移植ADL输注的方案在全部5只非致敏的1个MHC-II DRB等位基因匹配的猴子中安全地诱导对胰岛同种异体移植物的长期(≥1年)耐受。在严格的临床前同种异体移植NHP模型中获得的这些发现是独特的，并指出了人类非嵌合移植耐受性的第一种临床适用途径。

先前的NHP研究报告称，当在包括CD154阻断的非清髓性调理下给予供体骨髓时，对肾而非心脏或胰岛同种异体移植物具有耐受性。在那些研究中的一项研究中如此治疗的8只猴子中，有6只在没有维持免疫抑制的情况下维持了同种异体移植物肾功能1年；此外，其中3人维持长期功能而没有发生慢性排斥反应。在另一项研究中使用非嵌合策略，在接受供体特异性输血联合抗CD40L持续8周和雷帕霉素持续90天的5只猴子中，有3只获得了肾同种异体移植物的耐受性，但仅为不一致的。一个类似的NHP策略以及其他先前研究的策略在停止维持免疫抑制或进行雷帕霉素单药疗法后延长了胰岛同种异体移植物的存活期，但与我们的研究不同，这些方案都没有诱导持久的耐受性。与目前正在研究的其他基于细胞的耐受性策略相比，我们的方案不需要调节细胞的过继转移；相反，我们发现在短期免疫抑制下的围移植ADL输注在体内建立了有效和持续的免疫调节，涉及几种调节细胞类型。在安全性方面，我们的方案与混合嵌合策略不同，无需照射即可有效诱导稳定的耐受性、不加选择的全身性T细胞缺失、同步造血干细胞移植或一个疗程的钙调神经磷酸酶抑制剂或抗CD8耗竭抗体，以控制早期移植后直接途径激活。最后，与涉及可溶性肽和改变的肽配体疗法的其他抗原特异性策略不同，我们的ECDI固定白细胞输注与我们的临床前研究或临床试验(多发性硬化症中)中的过敏反应风险或任何其他安全问题无关。

在瞬时免疫抑制和对胰岛同种异体移植物的耐受性下，几种不同的免疫机制与我们的1个DRB匹配的ADL输注相关。所述方案在2次围移植ADL输注后早期耗竭同种异体反应性效应T细胞和B细胞，如在群组A中通过我们在四聚体研究中跟踪Ki67+增殖细胞、MLR中的同种异体反应性增殖、增殖TCRβ克隆和CD4+T细胞对不匹配的MHC I类同种异体肽的间接特异性的观察结果所证明。先前的鼠类研究表明，ADL输注后APC对凋亡小体的吸收显著增加了PD-L1/2表达，同时下调了正共刺激12。表现出这种模式的APC快速(但瞬时)激活T细胞，所述T细胞产生IFN-γ和IL-10，但不产生IL-2、IL-6和TNF-α，这是一种已知促进抗原特异性T细胞凋亡耗竭的细胞因子微环境。雷帕霉素是我们伴随免疫疗法的一部分，可在CD40:CD40L阻断下加强由供体抗原触发的激活诱导的细胞死亡。

在本研究中，在群组C(但不在群组B和D)中注意到循环CD4+和CD8+TEM细胞的移植后扩增、它们向移植物的募集以及供体反应性CD4+和CD8+T细胞的体外增殖受到抑制。这些发现表明我们的ADL输注和1个DRB匹配确实在耐受性诱导和维持中发挥了重要作用。我们在体外观察到调节亚群耗竭后供体的T细胞增殖恢复，表明供体特异性T细胞克隆没有被缺失或者无反应，而是调节控制了它们的移植后扩增和效应子功能。

进一步支持该解释，我们表明，在群组C中将ADL输注添加到短期免疫抑制中建立了一个调节网络，其特征为循环MDSC和Tr1、Treg、NS、Breg和B10细胞的显著和持续增加。在终止时，Tr1细胞在携带同种异体移植物的肝脏和群组C(相对于群组B)受体的淋巴结中也明显更普遍。形成该调节网络的详细机制仍有待确定。尽管如此，我们的1个DRB匹配的ADL输注可能提供大量共享的MHC-II肽，供MHC-II分子在宿主脾脏边缘区APC和宿主肝窦内皮细胞上呈递。众所周知，在对激活的T细胞进行胞啃后，这种肽MHC-II复合物可以向胸腺衍生的Treg(tTreg)细胞传递有效的激活信号，所述细胞具有偏向于自我识别的TCR库。已知Treg细胞可促进产生IL-10的Tr1细胞46的生成，但我们的研究中的Tr1细胞的扩增是否是由于激活的tTreg的影响以及由供体反应性T效应细胞的从头形成和/或转化引起仍有待确定。在自身免疫模型中，由与自身MHC-II结合的自身免疫疾病相关肽包被的纳米粒子生成的Tr1样细胞已知通过驱动同源B细胞分化为抑制疾病的调节B细胞而有助于调节网络的形成。与我们的研究中匹配的MHC-II肽促进调节网络的想法一致，1个DRB匹配的ADL的群组C受体中的循环Treg、Tr1和Breg细胞的频率显著高于完全不匹配的群组D受体的频率。

在调节亚群中，发现Tr1细胞对T和B细胞的供体特异性增殖表现出最有效的抑制，这部分是通过IL-10介导的。相比之下，第三方响应不受分选的Tr1细胞的影响，表明它们的抗原特异性。在群组C中(但不在群组B和D中)，我们的四聚体研究揭示循环Treg和Tr1细胞在移植后持续增加，对错配的供体MHC-I肽具有间接特异性。该发现证实了它们的抗原特异性，并且与之前对鼠类和人类同种异体移植物受体的研究一致，表明在1个MHC-II等位基因匹配的输血后，共享的自身MHC-II分子通过不匹配的MHC-I肽呈递诱导调节。ADL增加了完全不匹配的鼠类同种异体移植物受体的调节亚群6；MHC-II匹配在这些模型中的作用仍有待研究。在群组C受体中，Tr1细胞表现出独特的免疫细胞信号传导，包括SH2D2水平显著提高。T细胞特异性衔接蛋白(TSAd)是Sh2D2a的基因产物，通过与Lck51的相互作用调节TCR信号传导；然而，它的缺失会促进全身性自身免疫。在群组C中，Tr1细胞转录组学谱还表明Tr1细胞中的线粒体呼吸活动和能量利用增加，揭示了它们的激活状态。

在群组B(无ADL输注)中，7名受体中有2名在移植后1年内维持无免疫抑制的同种异体移植物存活，并且所有7人都避免了急性排斥反应，证实了当在MHC-II匹配的受体中通过有效诱导抑制早期直接途径激活时，可以实现有利的同种异体移植物存活。然而，此方案未能控制间接途径激活，如大多数群组B受体的从头DSA发展所证明。瞬时免疫抑制下的1个DRB匹配的ADL输注的致耐受性功效在致敏群组E受体中有限，特别是在那些具有预先形成的DSA的受体中，所述受体的记忆T细胞，包括那些不分泌IFN-γ的细胞是DSA响应所必需的，并且所述受体的APC被摄取DSA调理的ADL激活，可能是引发的而非耐受的供体反应性T细胞。图7和8示出了作为在基线时对供体抗原敏感的群组的一部分的胰岛移植受体中的数据(图7)和在MHC I类和II类(包括还有DRB等位基因)与供体完全不匹配的受体猴子中的数据(图8)。

方法

研究动物

所述群组包括从AlphaGenesis,Inc,Yemassee,SC的国家健康和传染病研究所群落(National Institute of Health and Infectious Diseases colony)获得的印度血统的专门孵育的猴子(猕猴(Macaca mulatta))供体和受体。探索组包括3只雄性，年龄为7.3±0.1岁且体重为12.5±1.5kg。对照群组包括8只雄性，年龄为4.3±2.1岁且体重为6.2±1.6kg。实验群组包括7只雄性和1只雌性，年龄为4.1±1.7岁且体重为5.2±1.2kg。供体群组包括19只雄性，年龄为6.7±3.3岁且体重为11.7±3.6kg。动物没有疱疹病毒-1(B病毒)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、D型猿猴逆转录病毒(SRV)和猿猴T淋巴细胞病毒(STLV-1)。资格另外包括ABO相容性和研究定义的MHC匹配(MHC-I不同和1个MHC-II DRB等位基因匹配的供体-受体对)。所有动物均通过454焦磷酸测序(威斯康星国家灵长类动物研究中心的遗传服务部门)60进行高分辨率MHC-I和-II基因分型。它们可以自由饮水并根据体重(BW)喂食饼干(Harlan Primate Diet 2055C,Harlan Teklad,Madison,WI)。它们的饮食每天都富含新鲜水果、蔬菜、谷物、豆类、坚果和复合维生素制剂。对所有动物进行半年一次的兽医体检。动物被社会安置并参与了旨在鼓励感官参与、增强觅食行为、寻求新奇事物、促进精神刺激、增加探索、玩耍和活动水平以及加强社会行为的环境丰富计划，从而共同为动物提供增加花在物种典型行为上的时间预算的机会。猴子被训练在医疗程序中进行合作，包括手动喂食和饮水、转移到运输笼子中以及进行检查、药物施用、代谢测试和血液采集，并配备了留置的中央和门静脉内血管通路。糖尿病是由STZ(100mg/kg IV)诱导的，并通过基础C肽<0.3ng/mL和对静脉内葡萄糖激发的阴性C肽响应得到证实61。对受体猴子的监测包括研究人员的每日临床评估、兽医人员的定期评价以及每周的血液学和化学实验室研究。本研究中的所有动物的护理和治疗均得到明尼苏达大学机构动物护理和使用委员会(Universityof Minnesota Institutional Animal Care and Use Committee)的批准，并符合实验动物护理和使用指南(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)(实验动物资源研究所，国家研究委员会，美国卫生与公共服务部(Institute of Laboratory AnimalResources,National Research Council,U.S.Department of Health and HumanServices))中的建议来进行。

免疫细胞表型的流式细胞术分析

对来自群组B-E猴子的冷冻保存的外周血单核细胞(PBL)、来自肝脏(LMNC)和淋巴结(LN)样品的组织浸润单核细胞进行多色流式细胞术分析。将1×10

门控策略

首先，细胞在FSC-H对比FSC-A上进行门控，且接着在SSC-H对比SSC-A上进行门控以区分双联体。图1A-1C，图2。然后基于充分表征的SSC-A和FSC-A特征对淋巴细胞进行门控。基于活力染料排除死细胞。以下表型特征用于定义免疫细胞群体：T细胞：CD3

供体特异性T和B细胞响应

对来自胰岛供体和移植受体的冷冻储存的PBL样品进行混合淋巴细胞反应(MLR)。来自受体猴子的响应PBL(300,000个细胞)样品用2.5μM CFSE(Invitrogen，目录号C34554)标记，并与来自胰岛供体(供体)和无关的MHC错配供体(第三方)的辐照(3000cGy)的VPD-450标记(BD，目录号562158)的刺激剂PBL(300,000个细胞)共培养。在另一组实验中，来自初始响应猴子的CFSE标记的PBL与来自胰岛供体的ECDI固定PBL(ADL)共培养(300,000个细胞)。制备凋亡供体白细胞(ADL)。在MLR的第6天，在CD4

评估供体刺激的Tr1细胞的多功能细胞因子谱。在终止时收集来自群组B(n＝3)、群组C(n＝3)和群组E(n＝2)猴子的外周血的T细胞。简而言之，在供体PBL(VPD-450标记)存在下，以1:1的比率将响应受体PBL(1x10

ELISPOT。对于IFN-γELISPOT测定，将从群组B和群组C猴子纵向收集的PBL解冻、洗涤，并在12孔培养板中在37℃、5％CO

致敏筛选(供体特异性抗体，DSA)。在不同时间点收集来自受体RM的血清，并通过流式细胞术检测DSA的存在。简而言之，将保存的供体PBL解冻并用完全RPMI洗涤后，以4×10

检查免疫调节的抑制测定

所有指定的调节亚群都从群组C猴子中分选。从新鲜收集的血液中获得的PBL用CD4、CD49b和LAG-3标记用于在无菌PBS中的Tr1细胞(CD4

在耗竭测定中，Treg、Breg和Tr1细胞从移植后12个月收集的群组C猴子的PBL中耗竭。图3.相同数量的CFSE标记的总PBL(未耗竭)或Treg耗竭(非CD4

为了确定分选细胞的抑制能力，在疫苗接种和移植前在基线收集的初始受体PBL在单向CFSE Flow-MLR中用辐照的VPD450

Tr1细胞中siRNA介导的SH2D2抑制

流式分选的Tr1

四聚体制备和染色

为了能够在这些具有MHC II类四聚体的猴子中追踪具有间接同种异体肽特异性的CD4

用于跟踪供体反应性T细胞的TCR测序

使用基于RNA的TCRβ链CDR3区高通量测序来不时比较群组A猴子在ADL输注前后的整个T细胞克隆库。这种方法优于需要设计和优化跨越整个V基因片段的多重引物组的基因组方法；这些在猴子中仍然定义不明确。使用RNeasy Plus Universal(Qiagen)从冷冻的PBL中提取总RNA，并从总RNA的聚A尾级分产生第一股cDNA。简而言之，在逆转录酶反应中使用定制设计的oligo dT引物和模板转换引物合成cDNA，该cDNA被用作使用特异性针对猕猴TCR恒定区和模板转换序列的引物对TCR VDJ区进行靶向PCR富集的模板。来自每个样品的富集VDJ扩增子通过PCR进行唯一双重索引，以在测序过程中实现多重兼容性。所有PCR扩增均使用KAPA HiFi HotStart DNA Polymerase ReadyMix试剂盒(Roche)进行。将索引扩增子文库等摩尔汇集，并用SPRI珠(Ampure XP，Beckman Coulter)清理。最终汇集物在MiSeq(Illumina)300bp配对末端运行(v3试剂盒)上测序。TCR NGS文库的制备和测序在明尼苏达大学基因组学中心(University of Minnesota Genomics Center)进行。使用设置参数(ILLUMINACLIP:all_illumina_adapters.fa:2:30:10 LEADING:3TRAILING:3SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:70)通过trimmomatic68清除原始的QC-ed短读段。预处理的读段直接输入到MiXCR69中，用于以默认设置(https://mixcr.readthedocs.io/en/latest/rnaseq.html)进行TCR谱分析。恒河猴中已知的TRB克隆类型用作参考。使用定制的阈值进一步过滤产生的TRB克隆类型，克隆分数为≥0.5％。通过将单个时间点的克隆频率除以所有鉴定的映射TCR克隆的平均频率来计算克隆扩增频率。基线时的大多数供体特异性TCR克隆非常低或无法检测到，因此我们使用峰值增殖作为基线并分析了那些扩增T细胞克隆的命运。

用于检查分选Tr1细胞中的基因表达的RNASeq

使用Illumina Hiseq 2500平台50bp配对末端读段对RNA样品进行测序。通过CASAV 1.8P/F过滤器的原始序列由fastqc(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc)评估。读段映射通过Hisat2(v2.0.2)使用UCSC人类基因组(hg38)作为参考来进行。Cuffdiff 2.2.1用于以FPKM(每百万映射读段的每千碱基外显子映射的片段)为单位来定量每个已知基因的表达水平。差异表达的基因使用CLCGWB(Qiagen,Valencia,CA)中的edgeR(负二项式)特征使用原始读段计数进行鉴定。DEG以色标表示。使用非人类灵长类动物或人类基因组数据库对表达的转录物进行注释。结果按倍数变化的绝对值排序，并鉴定群组B与群组C之间的DEG。根据最小1.5X绝对倍数变化和原始p值<0.01过滤生成的列表。这些DEG被导入Ingenuity Pathway Analysis Software(Qiagen,Valencia,CA)以进行途径鉴定。图1C。

ADL处理、释放测试和输注

在相对于胰岛移植的第-7天，从供体猴子脾脏中分离脾细胞，裂解RBC，并且剩余的细胞用尼龙毛柱(Polysciences，Inc.)富集B细胞。将细胞(80％)在冰上用含ECDI(30mg/ml每3.2x10

为了满足第+1天输注的ECDI固定ADL的目标剂量，相对于胰岛移植，在第-15天和-7天从供体猴子抽取的血液和剩余20％的脾细胞通过使用非人灵长类动物CD20珠(Miltenyi Biotech)的磁性分选富集B细胞，并在GREX100M烧瓶(Wilson Wolf)中，在rhIL-10(10ng/ml)、rIL-4(10ng/ml)、rhBAFF(30ng/ml)、rhTLR9a(10ng/ml)和rhCD40L-MEGA或rhCD40L多聚体(500ng/ml)和rhAPRIL(50ng/ml)两者存在下离体扩增至第+1天。在收获前24小时用rhIL-21(5ng/ml)刺激扩增的细胞。受体在输注前用苯海拉明12.5mg、对乙酰氨基酚160mg和昂丹司琼4mg PO的组合进行预处理。

瞬时免疫抑制

对群组A-E中的所有受体猴子施用免疫抑制。为了覆盖群组A、C、D和E猴子中的所有ADL输注，相对于第0天的胰岛移植，在第-8或-7天向群组A-E中的所有受体给予每种药物的第一剂量。拮抗性抗CD40 mAb 2C10R4由NIH Nonhuman Primate Reagent Resource提供，在第-8、-1、7和14天以50mg/kg IV给予。从移植后第-7天到第21天PO给予雷帕霉素

胰腺采购、胰岛加工和释放测试、胰岛移植和胰岛移植物功能评估

群组C-E中的供体猴子进行了全胰腺切除术，且胰岛被分离、纯化、培养7天以最小化直接途径刺激能力，并进行质量控制。在第0天，内毒素含量为≤1.0EU/受体BW kg的DNA64的≥5,000IE/kg的目标数量使用留置的门静脉内血管通路端口非手术移植到STZ糖尿病RM中。具有完全移植物功能的动物在移植后第21天停止保护性外源胰岛素。代谢监测包括每日上午/下午血糖、每周C肽、每月HbA1c、混合膳食测试和双月IVGTT，以确定对葡萄糖的急性C肽响应和葡萄糖消失率(Kg)。

胰岛移植物的组织病理学

将肝脏标本从每个受体中的10个不同解剖区域获得，在10％福尔马林中固定，并进行常规组织学处理。来自10个块中的每一个的切片用苏木精和伊红(H&E)染色或进行胰岛素免疫染色，以对移植的胰岛进行评分。通过在移植物组织病理学的尸体剖检中证明大量完整的A型和轻度浸润的B型胰岛没有或很少有C型至F型胰岛(中度至显著浸润的胰岛和部分或完全被浸润或纤维化替代的胰岛)，证实了无排斥反应的胰岛同种异体移植物存活。

ADL诱导供体特异性T和B细胞克隆的失败扩增

在3只非移植、非糖尿病、1个DRB匹配的群组A猴子中，在短期免疫抑制下ADL输注后早期监测细胞免疫揭示了一些发现。从第一次ADL输注后1天(第-6天)开始，循环MDSC的频率显著增加，并且直导第+7天的整个随访结束时保持升高。Ki67

为了通过对错配供体HC-I Mamu A00427-41肽的间接特异性追踪CD4

这些猴子中的VDJ区的克隆型分析表明，在ADL输注后，约30个T细胞克隆的频率发生了改变。具有不同Vβ链(4-Vβ5，Vβ4、Vβ7、Vβ9、Vβ11、Vβ12和Vβ28各3个)的几个T细胞克隆中的变化表明ADL输注靶向多个同种异体反应性克隆；与同种异体反应性是多克隆的概念一致。单个T细胞克隆分析展现多个克隆的扩增失败且随后缩小5至8倍。因此，一些证据表明ADL输注引起扩增，然后是供体特异性T和B细胞缩小。

ADL在1个DRB匹配的RM中促进稳定的胰岛同种异体移植耐受性

在接受短期免疫抑制的7只链脲佐菌素(STZ)-糖尿病1个DRB匹配的群组B猴子中，有2只接受了8天培养的胰岛同种异体移植物的门内移植≥365天(图6a和6b)。在5只群组C猴子中的5只中，向短期免疫抑制中加入ADL输注与显著改善的存活率相关(P＝0.021)；在移植后≥365天，所有5只都表现出胰岛同种异体移植物的操作耐受性(图6a、6b)。群组C猴子#13EP5在移植后立即变为正常血糖并保持如此，即使在移植后第21天停止免疫抑制和外源性胰岛素之后也是如此；该受体的HbA1C水平在移植后变得正常并保持正常。在其他群组C猴子中也观察到的移植后体重持续增加与治疗方案的总体安全性一致。所有5个受体的移植前血清C肽水平和对葡萄糖刺激的响应均为阴性。在猴子#13EP5中，强阳性移植后禁食和随机血清C肽水平的以及其在整个1年随访期间刺激后的增加证实了稳定的胰岛同种异体移植物功能。该受体在静脉内葡萄糖激发后表现出稳定的移植后血糖消失率(Kg)，与STZ前的血糖消失率相当；从匹配测试得出的C肽水平显示在整个移植后过程中显著增加>1ng/ml。尸体剖检时该受体肝脏的组织病理学分析揭示有许多完整的胰岛，没有或有极少胰岛周围浸润。移植的肝内胰岛对胰岛素呈强阳性染色；尸体剖检时天然胰腺中不存在胰岛素阳性胰岛β细胞表明，移植后血糖正常反映了移植物功能，而不是由于STZ诱导的糖尿病之后的缓解。移植后1年未处死群组C猴子#15CP1；在停止免疫抑制后，该受体的胰岛同种异体移植物功能持续了>2年。在猴子#15CP1的尸体剖检时，组织病理学证实无排斥反应的胰岛同种异体移植物存活并且在天然胰腺中不存在胰岛素阳性β细胞。相比之下，群组B猴子#15CP3在移植后变得血糖正常，但移植后4个月开始明显出现移植物功能恶化。1个月后的尸体剖检证实了排斥反应，其证据是少量的胰岛素阳性胰岛β细胞被单核细胞严重浸润。总之，这些结果证明了ADL治疗的RM中的1个DRB匹配的胰岛同种异体移植物的长期功能和组织学存活，即使在停止免疫抑制后也如此，表明在严格的转化模型中具有稳健的耐受性。

ADL抑制效应细胞扩增和供体特异性抗体(DSA)诱导

在群组B和C受体中比较了效应细胞和抗体响应。在移植后3、6和12个月，CD3

ADL扩展了抗原特异性调节网络

接下来，我们比较了群组B和C猴子中的淋巴样和髓样细胞的频率与调节表型。我们发现，ADL治疗的群组C猴子在移植后3、6和12个月在循环中的Tr1细胞以及处死时的LMNC和LN的频率显著高于未治疗的群组B猴子。此外，我们还发现，在整个移植后随访期间，ADL治疗的群组C猴子的循环自然抑制(NS)和Treg细胞的百分比显著高于未治疗的群组B猴子。与群组B猴子相比，群组C的调节性B(Breg)细胞、B10细胞和MDSC在移植后随访期间在循环中也显著更丰富，且除了MDSC外，在处死时在肝脏和LN中也显著更丰富。在移植后9个月和12个月的群组C PBL(与未修饰的受体PBL相比)中，Treg、Breg和Tr1细胞的耗竭与供体的CD4

对来自群组B和C猴子的流式分选Tr1细胞中的差异表达基因(DEG)的分析鉴定了258个基因。对DEG进行分组揭示，免疫细胞信号传导和线粒体呼吸是群组C中分选的Tr1细胞中激活的2个主要生物学途径，但群组B则为RM。我们对DEG的z评分的热图分析表明，仅在群组C中，Tr1细胞中的免疫信号传导中间体显著上调。与群组B相比，免疫细胞信号传导的前3个调节因子，即SH2D2、XBP1和SUMO2的相对转录物在群组C的Tr1细胞中显著上调，表明群组C Tr1细胞处于激活状态。我们对映射到线粒体呼吸的DEG的热图z评分分析表明，群组C Tr1细胞聚集在1端，表明所述细胞具有高度的代谢活性。调节线粒体呼吸的NDUSF家族成员NDUFS4和NDUFS5在群组C Tr1细胞中显著上调。在移植后12个月，用靶向SH2D2转录分子的小干扰RNA(siRNA)处理从耐受性群组C猴子分选的Tr1细胞降低了Tr1细胞响应供体而抑制CD4

在完全错配的群组D猴子中，在完全错配的RM ADL输注中ADL的致耐受性效力似乎减弱了，与3名受体中的2名的同种异体移植物功能延长相关。但在第三名受体中，移植物在移植后120与150天之间被排斥；在该受体中，在该受体中未抑制TEM细胞的扩增。ADL输注后，群组D中的Treg(1.4倍)和Tr1(0.98倍)细胞在移植后6个月的扩增不如群组C猴子(2.3倍和2.1倍，P＝0.04)显著；此外，在移植物被排斥的群组D受体中，供体特异性T细胞的增殖没有受到抑制。与群组B相比，3类Tr1细胞-产生IL-10、肿瘤生长因子β(TGF-β)和双重IL-10加TGF-β的细胞的频率在群组C中显著增加，但在群组D中没有显著增加。在处死时从2个具有长期同种异体移植物功能的群组D受体分离的Tr1细胞使T和B细胞的供体反应性增殖减少了>45％，相比之下，对于群组C Tr1细胞，当以相同比率添加到CFSE-MLR时，该减少为>75％。处死时获得的PBL耗竭Tr1细胞使T和B细胞两者的供体特异性增殖均增加≥45％。因此，完全错配的ADL的输注也可以建立供体特异性调节。

一个DRB匹配的ADL扩增同种异体抗原特异性Treg和Tr1细胞

我们使用MHC-II四聚体来监测对自身(共享)MHC-II以及错配的供体MHC-II和MHC-I肽具有间接特异性的循环CD4

相反，在群组C中，对错配的供体MHC-I肽具有特异性的非调节性CD4

实施例2

缺乏生物标志物与移植胰岛功能丧失有关

移植前供体特异性免疫响应的致敏或存在已被证明会严重阻碍人类和动物模型中移植的实体器官或细胞移植物的长期功能或耐受性的诱导。本临床前模型中存在供体特异性抗体导致移植胰岛的抗体介导的排斥反应加速。在使用预先存在的供体特异性抗体对非人类灵长类动物施用耐受方案后，分析了连续外周血样品中Tr1细胞的存在。外周血样品分析表明，耐受方案的施用导致移植后(第14天)Tr1细胞的频率降至低于在初始状态下观察到的水平(平均0.59±0.24)，且Tr1细胞没有这样增加(表明未能诱导供体特异性耐受性)与胰岛同种异体移植物功能的丧失有关。图7。

耐受性生物标志物的丧失先于移植物功能的丧失

在目前非人类灵长类动物的临床前移植模型中，对完全错配的胰岛同种异体移植物受体施用ADL+TIS导致移植物功能在移植后约300天丧失，而在一个DRB匹配的受体中进行移植导致移植的胰岛的无限期存活和功能(≥365天)。为了测试Tr1细胞的丧失是否先于该受体亚群的移植物功能丧失，通过流式细胞术在移植前和移植后从完全错配的胰岛移植受体收集的外周血样品中连续分析了Tr1细胞的频率。与一个DRB匹配的组类似，ADL+TIS的施用导致第90天Tr1细胞频率的倍数变化显著增加(3.98±0.98)，然后在第180天减少(1.98±0.75)并且在第300天达到在初始状态下观察到的水平(1.19±0.1)。循环Tr1细胞频率的降低与移植物功能的完全丧失相关。这些观察结果强烈表明Tr1细胞的丧失(表明耐受性生物标志物的丧失)先于移植物功能丧失约120天。图8。

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所有出版物、专利和专利申请均以引用的方式并入本文。虽然在前面的说明书中已经关于本发明的某些实施方案描述了本发明，并且为了说明的目的已经阐述了许多细节，但是对于本领域技术人员将显而易见的是，本发明容易想到另外的实施方案，并且某些本文描述的细节可以在不背离本发明的基本原理的情况下有相当大的变化。

在描述本发明的上下文中，术语“一个/种(a)”和“一个/种(an)”以及“所述”以及类似指称的使用应被解释为涵盖单数和复数两者，除非在本文另外地指示或明显地与上下文矛盾。除非另有说明，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应解释为开放式术语(即，意味着“包括但不限于”)。除非本文另外指明，否则本文中值范围的列举仅仅意图用作个别地表示属于所述范围的各单独值的速记方法，并且犹如本文个别描述地那样将各单独值并入到本说明书中。除非本文中另外指明或与上下文明显矛盾，否则本文中所描述的所有方法都可以按任何合适的顺序进行。本文所提供的任何以及所有实例或示例性语言(例如，“如”)的使用仅意图更好地说明本发明，并且除非另外要求，否则不会对本发明的范围施加限制。本说明书中的语言不应解释为将任何非要求的要素指示为实践本发明所必需。

本发明的实施方案在本文中描述，包括发明人已知的实施本发明的最佳模式。阅读上述说明书后那些实施方案的变体对于本领域普通技术人员可以变得显而易见。发明人希望技术人员视情况采用此类变体，并且发明人意图以不同于如本文所特别描述的方式来实践本发明。因此，只要法律允许，本发明包括此处所附权利要求书中叙述的主题的所有修改和等效物。此外，除非本文另外指示或明显地与上下文矛盾，否则本发明涵盖其所有可能变体中的上述要素的任何组合。