釉基质蛋白对成纤维细胞和角质形成细胞生物学功能的影响及其对兔耳创面愈合影响的实验研究

摘要

皮肤软组织缺损后的创面修复是整形外科中经常遇到的问题。创面愈合过程涉及一系列细胞和细胞因子之间的相互作用，寻找能够促进创面愈合的新型药物是科研的主要目的。釉基质蛋白（EMPs）已广泛应用于促进牙周组织再生的治疗，具有肯定的疗效。然而，釉基质蛋白对皮肤软组织缺损愈合影响的研究尚少。本研究分别将釉基质蛋白作用于体外培养的人成纤维细胞和角质形成细胞，观察其对这两种伤口愈合过程中主要参与细胞的生物学性质的影响，然后将釉基质蛋白应用于兔耳创面模型，观察其对皮肤创面愈合的影响。实验方法和结果概述如下：
　　1、釉基质蛋白对成纤维细胞生物学性质的影响
　　取包皮环切术后人包皮组织，采用组织块法培养人皮肤成纤维细胞。取3～6代细胞进行实验。配置不同浓度的EMPs工作液，使EMPs终浓度分别为25、50、100和200μg/mL。
　　①细胞黏附实验中，取细胞以106/ml浓度接种于预铺不同浓度EMPs的96孔培养板，每孔加0.2ml，作为实验组（EP1、EP2、EP3、EP4组）；取0.2ml相同浓度细胞悬液加入未预铺EMPs的板孔作为对照组。分别于细胞接种1.5、3和4.5h后洗去未黏附细胞，用MTT比色法测定黏附细胞的数量。结果显示，各时间点EP2、EP3、EP4组与对照组相比，差异均有统计学意义(P<0.05)，EP1组与对照组间差异无统计学意义。
　　②细胞增殖实验中,以不同浓度的EMPs工作液再悬细胞至终浓度为5×104/ml加入96孔培养板，每孔加0.2ml作为实验组（EP1、EP2、EP3、EP4组）；取0.2ml相同密度不含EMPs的细胞悬液加入96孔板作为对照组。分别于细胞接种后2、4、6、8天用MTT比色法测定细胞的数量。在第2天，各组之间差异均无统计学意义(P>0.05)；第4天，EP2、EP3、EP4实验组吸光度值高于对照组(P<0.05)，EP1组与对照组差异无统计学意义；第6天，EP2、EP3、EP4实验组与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)，EP1组与对照组差异无统计学意义；第8天，EP2、EP3实验组同对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)，EP1、EP4组与对照组差异无统计学意义。
　　③Ⅰ型胶原前mRNA合成测定实验中，以不同浓度的EMPs工作液再悬细胞至终浓度为106/ml浓度置于6孔培养板，每孔加2ml，作为实验组（EP1、EP2、EP3、EP4组）；取2ml相同密度不含EMPs的细胞悬液加入6孔板作为对照组。培养第5天终止培养，以RT-PCR法测定Ⅰ型胶原前mRNA合成量。结果显示，EP2、EP3、EP4组Ⅰ型胶原前mRNA合成量高于对照组。
　　2、釉基质蛋白对角质形成细胞生物学性质的影响
　　取包皮环切术后人包皮组织，采用消化法培养人角质形成细胞。取第3代细胞进行实验。配置不同浓度的EMPs工作液，使EMPs终浓度分别为25、50、100和200μg/mL。
　　①细胞黏附性实验中，取细胞以6×104/ml密度接种于预铺不同浓度EMPs的96孔培养板，每孔加0.2ml，作为实验组（EP1、EP2、EP3、EP4组）；取0.2ml相同密度细胞悬液加入未预铺EMPs的板孔作为对照组。分别于细胞接种1.5、3、4.5和6h后吸去未黏附细胞，用MTT比色法测定黏附细胞数量。1.5h时，各实验组与对照组差异无统计学意义；3h时，EP2组与对照组差异有统计学意义(P<0.05)，EP1、EP3、EP4组与对照组差异无统计学意义；4.5h时，EP2、EP3、EP4组与对照组差异有统计学意义(P<0.05)，EP1组与对照组间差异无统计学意义。6h时，EP3、EP4组与对照组差异有统计学意义(P<0.05)，EP1、EP2组与对照组差别无统计学意义。
　　②细胞增殖实验中,以不同浓度的EMPs工作液再悬细胞至终浓度为4×104/ml加入96孔培养板，每孔加0.2ml作为实验组（EP1、EP2、EP3、EP4组）；取0.2ml相同密度不加EMPs细胞悬液加入96孔板作为对照组。分别于细胞接种后2、4、6、8天用MTT比色法测定细胞的量。各时间点各组之间差别均无统计学意义。
　　③细胞体外划痕实验中，以不同浓度的EMPs工作液再悬细胞至终浓度为2×105浓度置于12孔培养板，每孔加2ml,作为实验组（EP1、EP2、EP3、EP4组）；取2ml相同密度不加EMPs细胞悬液加入12孔板作为对照组。培养过程中，细胞培养液中均加入5ug/ml的丝裂霉素C以抑制细胞增殖。24小时后用体外划痕法测定体外创面的愈合率。各实验组与对照组愈合率差异无统计学意义。
　　3、釉基质蛋白对兔耳创面愈合的影响
　　选取日本大耳白兔5只，每侧兔耳制作直径1cm大小创面4个。术后每天以1.5mg/cm2EMPs+载体涂抹左耳创面，设为EMPs治疗组，右耳创面仅涂抹载体作为对照组。观察创面愈合情况并于术后即时及3、6、9、12、15天照相，应用ImageJ图像分析软件测量未愈合创面面积，以下面公式计算创面愈合率:愈合率=(原始创面面积-现有创面面积/原始创面面积)×100％。当愈合率大于90％时判定为创面愈合。记录各创面愈合时间。第3、6天治疗组和对照组间差异均无统计学意义，第9、12、15天治疗组创面愈合率高于对照组(P<0.05)。治疗组平均愈合时间为11.4±0.95天，对照组平均愈合时间为15.6±0.82天，二者差异有统计学意义(P<0.05)。
　　通过本实验研究，可以认为釉基质蛋白有促进皮肤创面愈合的作用。它可以促进成纤维细胞的粘附、增殖及Ⅰ型胶原前mRNA合成；对角质形成细胞则仅能促进其粘附，对其增殖、迁移则无明显作用。由此推测，主要是成纤维细胞参与了釉基质蛋白促进创面愈合的作用。

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缩略语表

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前言

文献回顾

釉基质蛋白及其促组织修复的研究进展

成纤维细胞与创面修复

角质形成细胞与创面修复

正文

实验一 釉基质蛋白对人皮肤成纤维细胞黏附、增殖及Ⅰ型胶原前 mRNA 合成的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二釉基质蛋白对人角质形成细胞黏附、增殖及迁移影响的体外研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验三 釉基质蛋白对兔耳创面愈合的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

附图

个人简历和研究成果

致谢