反义策略阻断外排泵出系统逆转多重耐药铜绿假单胞菌及耐氟喹诺酮类大肠埃希杆菌耐药性的研究

摘要

背景与目的：
　　铜绿假单胞菌和大肠埃希杆菌是引起临床感染性疾病较常见的致病菌。由于抗生素的长期大量使用，特别是不规范地滥用抗生素，导致了日益严重的细菌耐药性问题，细菌耐药可导致患者感染率增加，感染持续时间延长，不恰当治疗增加，住院时间延长，医疗费用增加，甚至死亡率上升。多重耐药铜绿假单胞菌(MDR-PA)有较高的感染率和病死率，是导致烧伤病人死亡的独立危险因素。在我国耐喹诺酮类大肠埃希杆菌(FREC)的耐药率处于全球前列，给临床治疗疾病带来困难，也给医院感染控制提出了严峻的问题。因此，寻找一种新的控制MDR-PA及FREC感染的策略变得迫在眉睫。主动泵出系统在MDR-PA及FREC的耐药性产生方面起很关键的作用，MexAB-OprM是MDR-PA最主要的主动泵出系统，无论是与MexAB共同起作用还是单独起作用，由oprM基因编码的外膜蛋白OprM对多重耐药性的形成都起着非常重要的作用。AcrAB-TolC是大肠埃希杆菌的最主要的外排泵，AcrAB是决定细菌对氟喹诺酮类药物耐药的重要机制。在本研究中我们以oprMmRNA和acrBmRNA为靶基因，设计合成选择性针对oprMmRNA的硫代寡聚脱氧核苷酸(PS-ODNs617)和针对acrBmRNA的硫代寡聚脱氧核苷酸(PS-ODNs831)，制备纳米微粒脂质体递药系统，并通过该递药系统分别将PS-ODNs617和PS-ODNs831转运进入MDR-PA和FREC细菌内，旨在通过阻断MexAB-OprM和AcrAB-TolC主动泵出系统，进而逆转MDR-PA及FREC的耐药性，恢复两类致病菌对常用抗生素对的敏感性。
　　方法：
　　1.聚乙烯亚胺(PEI)-硫代寡聚脱氧核苷酸(PS-ODNs)纳米微粒脂质体的制备：以oprM和acrBmRNA为靶基因，设计合成针对oprMmRNA的硫代寡聚脱氧核苷酸(PS-ODNs617)和针对acrBmRNA的硫代寡聚脱氧核苷酸(PS-ODNs831)。将25KDa链状PEI与PS-ODNs通过静电相互作用制备成荷正电荷的聚乙烯亚胺-硫代寡聚脱氧核苷酸纳米微粒(PEI-ODN纳米微粒)，将蛋黄卵磷脂(EPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)和聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG2000-DSPE)以14:0.9:1摩尔比混合后，用薄膜分散法制备包裹PEI-ODN纳米微粒脂质体；用粒径分析仪测定纳米微粒和脂质体的平均粒径；用葡聚糖凝胶过滤法分离未被包封的PEI-ODN纳米微粒和脂质体；紫外法测A260nm值计算脂质体包封率；通过体外释放实验评估脂质体稳定性。
　　2.选择性抗oprMmRNA的PS-ODNs617逆转MDR-PA耐药性研究：用纳米微粒脂质体的方法将PS-ODNs617导入细菌体内，通过平板克隆形成实验计数菌落数(CFU)；测定PS-ODNs617对MDR-PA生长的影响；测定给予PS-ODNs617后，不同抗生素对MDR-PA的最小抑菌浓度(MIC)的变化；通过实时荧光定量RT-PCR法检测PS-ODNs617对基因oprM表达的抑制作用。实验中PS-ODNs617设3μg/ml、10μg/ml、30μg/ml和100μg/ml四个剂量组，同时设空白对照组、空白脂质体组、随机链对照组PS-ODNs0701(100μg/ml)、游离PEI组(5.5μg/ml)和游离PS-ODNs617组(100μg/ml)。
　　3．选择性抗acrBmRNA的PS-ODNs831逆转FREC耐药性研究：用纳米微粒脂质体的方法将PS-ODNs831导入细菌体内，通过平板克隆形成实验计数菌落数(CFU)；测定PS-ODNs831对FREC生长的影响；测定给予PS-ODNs831后，环丙沙星和左氧氟沙星对FREC的最小抑菌浓度(MIC)的变化；通过实时荧光定量RT-PCR法检测PS-ODNs831对基因acrB表达的抑制作用。实验中PS-ODNs831设3μg/ml、10μg/ml、30μg/ml和100μg/ml四个剂量组，同时设空白对照组、空白脂质体组、随机链对照组PS-ODNs0701(100μg/ml)、游离PEI组(5.5μg/ml)和游离PS-ODNs831组(100μg/ml)。
　　结果：
　　1．PEI-ODN纳米微粒脂质体的制备：包裹PEI-ODN纳米微粒的脂质体的粒径为(217.1±78.6)nm，平均包封率为(79.7?2.69)％。稳定性分析结果显示，将脂质体混悬液放置于4℃和室温14d后，脂质体的载药量分别为初始载药量的76.32％和70.1％。将脂质体混悬液放置于37℃2d后脂质体的载药量仅为初始载药量的61.69％，约40％的PS-ODNs渗漏到脂质体外，表明脂质体在体内37℃时有较好的释药率，可以缓慢将包裹的药物释放。
　　2.选择性抗oprMmRNA的PS-ODNs617逆转MDR-PA耐药性研究：与空白对照组相比，实验组(PS-ODNs617)的四个剂量组都能显著抑制M-H琼脂培养基上MDR-PA的生长(P<0.01)，并随着PS-ODNs617浓度的增加，抑制MDR-PA菌落生长的作用增强；实验组(PS-ODNs617)的四个剂量组的哌拉西林都能显著抑制MDR-PA的生长，并且具有浓度依赖性；实验组(PS-ODNs617)的四个剂量组都能使不同抗生素对MDR-PA的MIC值降低；real-timeRT-PCR结果显示实验组(PS-ODNs617)的四个剂量组能明显抑制oprMmRNA的表达(P<0.01)，并具有浓度依赖性抑制效应。游离PS-ODNs617组(100μg/ml)与空白对照组相比其作用比较小，而空白脂质体组、随机链对照组PS-ODNs0701(100μg/ml)和游离PEI组(5.5μg/ml)与空白对照组相比，其对MDR-PA的CFU、生长测定、MIC和oprMmRNA的表达均没有明显的影响。
　　3.选择性抗acrBmRNA的PS-ODNs831逆转MDR-PA耐药性研究：与空白对照组相比，实验组(PS-ODNs831)的四个剂量组都能显著抑制M-H琼脂培养基上MDR-PA的生长(P<0.01)，并随着PS-ODNs831浓度的增加，抑制FREC菌落生长的作用增强；实验组(PS-ODNs831)的四个剂量组的环丙沙星和左氧氟沙星都能显著抑制FREC的生长，并且具有浓度依赖性；实验组(PS-ODNs831)的四个剂量组都能使环丙沙星和左氧氟沙星对FREC的MIC值降低至敏感；real-timeRT-PCR结果显示实验组(PS-ODNs831)的四个剂量组能明显抑制acrBmRNA的表达(P<0.01)，并具有浓度依赖性抑制效应。游离PS-ODNs831组(100μg/ml)与空白对照组相比其作用比较小，而空白脂质体组、随机链对照组PS-ODNs0701(100μg/ml)和游离PEI组(5.5μg/ml)与空白对照组相比，其对FERC的CFU、生长测定、MIC和acrBmRNA的表达均没有明显的影响。
　　结论：
　　1．本研究制备的纳米微粒脂质体载药量大、包封率高、稳定性好，可以有效将硫代寡聚脱氧核苷酸转运到铜绿假单胞菌和大肠埃希杆菌菌体内。
　　2．抗oprMmRNA的硫代寡聚脱氧核苷酸能够选择性抑MDR-PA细菌体内MexAB-OprM主动泵出系统外膜蛋白的编码基因oprM的表达，从而抑制MexAB-OprM主动外排泵出系统的活动，完全或部分逆转MDR-PA对临床常用抗生素的敏感性。
　　3．抗acrBmRNA的硫代寡聚脱氧核苷酸能够选择性抑制FREC细菌体内AcrAB-TolC主动泵出系统内膜蛋白AcrB的编码基因acrB的表达，从而抑制AcrAB-TolC主动外排泵出系统的活动，完全恢复FREC对环丙沙星和左氧氟沙星的敏感性。

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缩略语表

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前言

文 献 回 顾

1. 细菌耐药的现状及对策

实 验 部 分

第一部分聚乙烯亚胺-硫代寡聚脱氧核苷酸纳米微粒脂质体的制备

1. 材料和方法

2. 实验结果

3. 讨论

第二部分选择性抗 oprM mRNA 的硫代寡聚脱氧核苷酸逆转 MDR-PA 耐药性研究

1. 材料和方法

2. 实验结果

3. 讨论

第三部分选择性抗 acrB mRNA 的硫代寡聚脱氧核苷酸逆转 FREC 耐药性研究

1. 材料和方法

2. 实验结果

3. 讨论

结 论

参考文献

个人简历及研究成果

致谢