TLR4信号调节小鼠B淋巴细胞发育的实验研究

摘要

目的：B淋巴细胞起源于多能造血干细胞，在整个发育过程当中经历了多个发育阶段，造血干细胞必须成功经过各个发育阶段后，才能成为一个正常发挥免疫应答功能的成熟B淋巴细胞。但是B细胞发育的精确调控机制可能会因许多病理条件而被扰乱，特别值得关注的是炎症的影响。Toll样受体是一种能够识别多种病原相关分子的蛋白，一旦识别病原相关分子之后，它们可以启动一系列反应激活免疫系统清除入侵病原微生物，从而构成机体免疫的第一道防线；TLR诱导产生炎性细胞因子，而许多这类因子对B细胞发育均有抑制作用。这两个原本独立的现象提示TLR信号与B细胞发育间存在某种关联。考虑到TLR信号对成熟B细胞功能具有直接而深刻的影响，一个显而易见的问题是TLR信号是否对发育中的B细胞也有类似的直接作用。在本试验中，我们检测了TLR4在各个阶段B细胞中的表达水平，检测了正常C3H/He小鼠和C3H/HeJ小鼠之间B细胞分布的区别，同时通过体内和体外试验检测了TLR4信号对发育中的B细胞的影响。
　　方法：通过实时荧光定量PCR检测TLR4在各个B细胞亚群中的表达水平；对C57BL/6小鼠腹膜内注射LPS，在不同时间点取骨髓通过细胞计数及流式检测B细胞及各个亚群的变化；流式细胞仪分析正常C3H/He小鼠和C3H/HeJ小鼠骨髓内全B细胞以及B细胞亚群的比例；FACs分选出的未成熟B细胞体外培养，LPS处理后通过CFSE染色检测增殖代数，通过流式检测培养细胞表面IgD、CD21、CD23、CD86的表达；FACs分选出的未成熟B细胞体外培养，分别用LPS、anti-μ或者LPS+anti-μ处理之后，流式检测细胞分化和凋亡的相关指标。
　　结果：（1）实时荧光定量PCR结果显示小鼠骨髓中四个B细胞亚群均表达TLR4，并且matureB细胞的表达水平明显高于前三个亚群，而脾来源的matureB细胞的表达水平又明显高于骨髓来源的matureB细胞；（2）对C57BL/6小鼠应用LPS处理后，发现处理后的小鼠骨髓细胞总数、全B细胞、preB细胞和immatureB细胞计数在第1周会明显下降，随后会出现反弹性的异常增高，在第3周的时候逐渐恢复正常水平；（3）在C3H/HeJ小鼠骨髓中，全B细胞、proB、preB细胞占总骨髓细胞的比例均明显高于正常的C3H/He小鼠，而immatureB和matureB细胞的比例没有统计学意义的差别；（4）ImmatureB细胞体外培养体系中应用LPS刺激后，IgD、CD21、CD23、CD86的阳性率均明显高于阴性对照组；（5）ImmatureB细胞体外培养体系中应用LPS、anti-μ或者LPS+anti-μ刺激后，发现LPS+anti-μ组的凋亡细胞比例明显低于anti-μ组，而其IgD阳性率则明显低于LPS组。
　　结论：（1）TLR4的表达水平在新生B淋巴细胞迁出骨髓后会有一个大幅度的提高，这种提高可能是受到外周环境当中的微生物组分和各种细胞因子的影响；（2）当小鼠体内TLR4信号过强时，骨髓内的B淋巴细胞也会出现异常发育，至于这种异常是由于早期造血干细胞向淋系的发育受阻还是由于B淋巴细胞的发育加速，经过我们的分析，这两种原因可能在这一过程中都起着一定的作用；（3）在TLR4功能缺失的小鼠体内B淋巴细胞的发育是异常的，主要是阻滞在proB、preB和immatureB细胞三个早期的阶段；（4）TLR4信号可以使immatureB细胞向成熟方向分化，并可以帮助自身免疫性B淋巴细胞逃避阴性选择过程免于凋亡；（5）LPS促进immatureB细胞分化成熟这一作用可以被anti-μ抑制掉。以上试验结果提示TLR4信号在体内外均可促进immatureB细胞的发育，而机体产生B淋巴细胞是一个极其复杂的过程，受着多种不同因素的影响。

目录

封面

声明

目录

缩 略 语 表

英文摘要

前 言

文献回顾

1 B 淋巴细胞的发育

2 Toll 样受体

3 TLRs 与 B 淋巴细胞的发育

正文

实验一 TLR4 信号调节小鼠 B 淋巴细胞发育的实验研究

实验二 TLR1-9 在各个 B 细胞亚群的表达水平以及骨髓来源的immature B 细胞和脾来源的 T1 B 细胞的区别初探

小结

参考文献

个人简历及研究成果

致谢