5-HT→5-HT2AR→PKC通路参与大鼠膈神经长时程易化的研究

摘要

【研究背景】
　　呼吸是维持机体新陈代谢和功能活动所必须的基本生理过程，呼吸节律可因内、外环境的变化而发生改变。我们把机体为适应环境变化需要而发生的呼吸运动输出的改变称为呼吸可塑性。呼吸可塑性的异常可引起呼吸功能的障碍，如婴儿猝死综合症（suddeninfantdeathsyndrome，SIDS）和阻塞性睡眠呼吸暂停综合症（obstructivesleepapneasyndrome，OSAS）等。因为与疾病发生的密切关系，人们更加关注病理状态下呼吸可塑性的调控机制。到目前为止，长时程易化（long-termfacilitation，LTF）模型是研究呼吸可塑性最常用的动物模型。LTF是指经过重复性的缺氧或药物干预后，诱导膈神经产生超出正常水平、持续增强长达1小时以上的高大放电效应。LTF的出现可以稳定上呼吸道并维持气道通畅，对睡眠呼吸紊乱疾病有潜在的治疗意义。
　　膈神经LTF（phrenicLTF，pLTF）在体情况下通常采用重复性缺氧来诱导，而在离体脑片培养模型中则采用间断性5-羟色胺(5-HT)灌流的方法来诱导。5-HT/5-HT2A受体(5-HT2AR)系统是LTF表达的必要条件，这一系统的异常往往导致呼吸紊乱的发生，然而对于5-HT系统激活后的细胞内信号转导途径还缺乏研究。在本研究中，我们通过低压氧仓间断性缺氧刺激模拟高海拔条件下的缺氧模式，建立了一个新的pLTF动物模型；另外，我们发现一次性系统给予外源性5-HT，可以兴奋膈神经放电并产生pLTF，这在以往研究中尚未有报导。应用我们构建的两种大鼠模型，结合药物干预实验，我们对pLTF的细胞内信号机制进行了研究。
　　【目的】
　　利用低压氧舱缺氧诱导和外源性5-HT诱导的pLTF模型，探讨5-HT→5-HT2AR→PKC通路在大鼠呼吸神经可塑性机制中的作用。
　　【方法】
　　(1)将大鼠置于密闭容器内，快速进行空气抽提，模拟9000～10000m高海拔环境，持续5分钟后，常氧通气5分钟，每日重复循环12小时，持续7天，进行慢性间断性缺氧(chronicintermittenthypoxia,CIH)预处理；第8天早晨给予3个循环的急性间断性缺氧(acuteintermittenthypoxia,AIH)刺激，立即进行膈神经放电记录；(2)大鼠经腹腔麻醉后，切断双侧迷走神经，腹腔注射箭毒阻断自主呼吸，股动脉插管以便进行血气和血压监测，股静脉插管建立药物及液体通道。颈部分离右侧膈神经，给予药物或间断性缺氧刺激，记录膈神经放电情况。
　　【结果】
　　大鼠经低压氧舱CIH预处理后，AIH诱导的膈神经放电幅度较正常对照组（单纯AIH诱导）增高近一倍，缺氧30min、60min后仍然维持高大放电，形成增强的pLTF；静脉给予5-HT2AR拮抗剂ketanserin，可以部分阻断低压氧舱CIH诱导的pLTF，而静脉给予PKCθ抑制剂，不仅完全阻断pLTF的发生，而且影响了膈神经的规律性放电。
　　不同剂量5-HT对与膈神经放电的影响有所差异，但是基本都有短暂抑制现象的发生。20μg/kg仅引起了轻微的膈神经放电抑制，但很快恢复正常水平；40μg/kg对放电幅度和频率均有短暂抑制，但是仍较快恢复正常水平；100μg/kg的5-HT可引起先抑制后兴奋的双相膈神经放电，膈神经放电幅度较正常增高约30％并持续1小时以上，最终形成pLTF。静脉给予5-HT2AR拮抗剂ketanserin可完全阻断5-HT诱导的pLTF，而5-HT1AR拮抗剂WAY100635则没有作用。静脉注射PKC抑制剂staurosporine虽不影响初始抑制，但抑制了兴奋效应，完全阻断pLTF。我们还发现5-HT引起的双相放电依赖于两种相对独立的机制，其中初始抑制与结神经节相关，而后续的兴奋作用则与颈动脉体密切联系。摘除结神经节后，初始抑制消失，5-HT引起膈神经放电的增强，形成更加高大的pLTF，而摘除颈动脉体后，5-HT使抑制增强并延长，兴奋作用消失，pLTF无法形成。
　　【结论】
　　复杂的呼吸网络主要由连续性的感觉神经传入、中枢信号整合及膈神经的运动输出所构成，pLTF的表达无疑需要整个呼吸网络系统的激活。事实上，我们在本研究中揭示了一种由颈动脉体兴奋和结神经节抑制作用形成的外周动态平衡机制，而这种机制在5-HT诱导的pLTF中起关键作用。无论是在间断性低压氧舱诱导还是在5-HT诱导的pLTF大鼠模型中，我们的实验结果均表明5-HT→5-HT2AR→PKC信号通路对于pLTF形成的重要性。我们的研究将拓宽对于LTF发生机制的认识水平，并且为睡眠呼吸紊乱疾病的治疗提供潜在的可能性。

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缩略语表

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前言

文献回顾

第一部分 呼吸可塑性的研究进展

1. 呼吸的长时程易化

2. 呼吸 LTF 的诱导

3. LTF 的神经调节机制

第二部分 呼吸中枢与呼吸调控研究进展

1. 呼吸中枢的研究现状

2. 呼吸的化学感受器

3. 结神经节与呼吸

4. 肺受体

5. 机械受体

正文

实验一 建立大鼠低压氧仓 pLTF 整体动物模型

1. 材料与方法

2. 结果

3. 讨论

实验二 5-HT2A/PKCθ途径参予低压氧仓诱导大鼠 pLTF 的形成

1. 材料与方法

2. 结果

3. 讨论

实验三 不同浓度外源性 5-HT 对膈神经放电的影响

1. 材料与方法

2. 结果

3. 讨论

实验四 外周机制对5-HT 诱导的pLTF的影响

1. 材料与方法

2. 结果

3. 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢