皮肤光老化机制研究—紫外线照射对成纤维细胞染色体端粒DNA复制的影响

摘要

皮肤老化包括自然老化与光老化，老化由很多机制共同作用引起。
　　端粒是由串联重复序列组成的位于线性染色体末端的结构，在人类是由（GGAGGG）n组成的，并在空间上形成特定的构象，控制着与老化相关的基因表达和细胞增殖能力的改变，与老化、肿瘤、基因调节密切相关，研究端粒在这些过程中的变化及其生物学功能是目前皮肤老化研究领域的热点。
　　端粒的长度及其正常结构的维持决定端粒的功能：直接从活体组织获得的细胞，端粒长度与生理年龄呈现负相关；培养细胞证明，细胞每分裂一次，端粒大约缩数十个至数百个碱基对。当端粒变得“相当短”时，细胞就进入老化阶段。从更深层次上说，端粒长度还可能影响其附近与老化相关的基因的表达。
　　日光中的紫外线是引起皮肤光老化最重要的环境因素。急性紫外线照射后，可以直接或间接激活老化相关的信号通路；还可以抑制胶原的合成最终引起老化相关改变。已证实的信息从多个方面表明自然老化及光老光有着共同的基本的分子通路。端粒是目前公认的细胞老化的分子标记，急性日光照射后是否也能使端粒缩短进入老化的终末通路是一个值得探索的课题。
　　本试验以人原代成纤维细胞为对象，采用紫外线照射和RT-PCR等技术观察急性紫外线损伤对细胞增殖活性及染色体端粒复制的影响,对光损伤光老化机制做了更进一步的研究。
　　一、紫外线对人成纤维细胞增殖活性的影响：
　　使用日光模拟器紫外连续光谱，光谱范围为290nm-400nm，以1000-10000mJ/cm2共十个剂量照射细胞，并用WST-8检测照射后成纤维细胞的增殖活性，发现剂量越高，细胞增殖活性越低。
　　二、自然传代细胞端粒长度变化的验证：
　　参考文献描述方法，我们对PCR的反应条件进行了探索和改进，建立了端粒及内参基因扩增的标准曲线；并验证了自然传代细胞端粒长度的动态学变化。
　　三、紫外线照射对成纤维细胞端粒长度的影响：
　　（一）、使用较小剂量(1000mJ/cm2)紫外线照射成纤维细胞后并传代，提取不同代数成纤维细胞的DNA，对比未处理组与紫外线处理组端粒长度的变化；结果显示，小剂量紫外线照射后其端粒长度有缩短趋势，但照射组与对照组相比没有统计学差异（P>0.05）；且随着传代数目的增加，两组端粒的长度均有逐渐缩短的趋势。
　　（二）、对于同代成纤维细胞，用不同剂量紫外线照射细胞后,不经传代，提取细胞DNA，并对比端粒长度的变化。结果示：高剂量(10000mJ/cm2)紫外线处理后成纤维细胞的端粒较未照射细胞显著缩短，差异有统计学意义（P<0.05）。
　　本实验利用实时定量PCR方法，成功扩增了成纤维细胞端粒重复序列，并验证了端粒可以随细胞传代而缩短的理论；证实单次大剂量紫外线可以显著缩短端粒长度，小剂量照射也可使染色体端粒轻度缩短。这些结果为研究细胞光老化提供了重要线索，有助于进一步理解皮肤光老化的内在机理。

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缩略语表

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前言

文献回顾

1. 紫外线的组成及作用

2. 老化的定义

3. 老化过程

4. 皮肤老化

5. 急性光损伤诱导光老化的机制

6. 端粒

正文

1 实验材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

致谢