胰岛素对胰岛β细胞磷脂酶Cγ1及其磷酸化水平表达的影响

摘要

研究背景
　　胰岛素由胰岛β细胞分泌后经血液循环运输至相应靶组织和靶器官(主要为肝脏、肌肉及脂肪组织)，与胰岛素受体(IR)结合发挥生理效应。胰岛素的主要作用是增加葡萄糖的跨膜转运，促进葡萄糖的摄取和糖原合成，并为合成蛋白或脂肪提供能量。此外，胰岛素在促进生长方面也发挥重要作用。
　　1995年,HarbeckMC等[1]通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法证明了在胰岛β细胞上也有IR和胰岛素受体底物(insulinreceptorsubstrate，IRS)mRNA的表达。继而在β细胞上发现了胰岛素信号转导的其它元件。目前已知至少有两条主要的信号转导途径：一是磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositide-3kinase，PI3K)信号转导途径，主要介导代谢调节；二是RAS信号转导途径，主要介导基因转录、细胞生长。
　　1983年,StrebH等[2]人首先报道三磷酸肌醇(IP3)可作为第二信使。此后人们对肌醇信号进行广泛的研究，发现激素、神经递质、多肽生长因子等,与细胞表面相应受体结合后,激活磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C（PI-PLC），活化后的磷脂酶C（PLC）能水解磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸(PIP2)，产生二酯酰甘油(DAG)和IP3，调节细胞的增殖、分化、分泌、收缩等生命活动。
　　PLC是磷脂酰肌醇信号通路的关键酶，在机体内分布极为广泛。到目前为止，在哺乳类动物中共发现12类PLC同工酶。按结构特点和调节激活机制,分为PLCβ(1-4)、PLCγ(1-2)、PLCδ(1-4)、PLCε和PLCζ五类。PLC同工酶的调节机制各不相同。既往研究已证明[3]PLCγ1由受体酪氨酸激酶（RTK）激活，活化后的PLCγ1水解PIP2，产生IP3和DAG。而胰岛β细胞IP3水平升高可引起Ca2+释放，调节胰岛素分泌。GasaR与KimSS等[4,5]报道在大鼠、小鼠胰岛和胰岛细胞瘤细胞系中均表达PLCγ1，但是否参与胰岛素分泌的反馈调节目前仍不清楚。我们的前期研究结果[6]提示高胰岛素血症，可造成胰岛素一相分泌的损害，但对于产生一相分泌损害的机制还不清楚。胰岛素受体系酪氨酸激酶受体，那么胰岛素孵育β细胞后是否对PLCγ1产生影响，进而影响胰岛素的一相分泌，目前尚未见报道。胰岛素通常与受体结合发挥作用，而β细胞亦表达胰岛素受体。因此，本研究拟观察PLCγ1在胰岛素作用不同时间的反应性及磷酸化水平表达。探讨其在胰岛β细胞内胰岛素信号转导中的作用。
　　目的
　　观察胰岛素作用对大鼠胰岛β细胞和βTC-3细胞内PLCγ1和磷酸化的PLCγ1蛋白表达的影响，探讨其在胰岛β细胞胰岛素信号转导中的作用。
　　方法
　　1、大鼠胰岛分离纯化。双硫腙溶液鉴定胰岛，通过HE染色观察纯化胰岛的形态特征，采用免疫组织化学方法并结合激光扫描共聚焦显微镜和图像分析技术对胰岛β细胞表达不同时间（0，30，60，120，240min）内的PLCγ1进行半定量分析。2、βTC-3细胞培养。取生长期的βTC-3细胞分三组，即insulin组（终浓度100mIU/L）、insulin+Genistein组（终浓度0.1mmol/L）、insulin+PTX组（终浓度0.1mg/L）。每组分0、30、60、120和240五个亚组，计数使每个亚组细胞数为5×106个。蛋白提取和定量。PLCγ1和磷酸化的PLCγ1Westernblotting实验。
　　结果
　　1、PLCγ1在胰岛β细胞表达,在胰腺的外分泌部也有表达。与0min比较,100mIU/L胰岛素处理30min胰岛β细胞表达的PLCγ1的荧光强度有明显降低(P<0.05)；240minβ细胞表达的PLCγ1的荧光强度与0min比较无明显差别(P>0.05)。磷酸化的PLCγ1在30min时与0min比较，荧光强度明显增强(P<0.05)，而后随着时间的延长逐渐降低，说明胰岛素作用后可使胰岛β细胞内的PLCγ1发生磷酸化。
　　2、在100mIU/L胰岛素孵育的βTC-3细胞五个亚组中，30min时PLCγ1的蛋白含量明显降低，而磷酸化的PLCγ1在30min时蛋白含量明显增高；在100mIU/L胰岛素中加入0.1mmol/L受体酪氨酸激酶的抑制剂Genistein后，发现30min时PLCγ1的蛋白含量并没有降低，而磷酸化的PLCγ1在30min时蛋白含量也无增高；在100mIU/L胰岛素中加入0.1mg/LPTX后，发现在30min时PLCγ1的蛋白含量依然明显降低，磷酸化的PLCγ1的蛋白含量仍然显著增高，与只用胰岛素孵育时PLCγ1的变化趋势相似。提示胰岛素作用导致的PLCγ1表达及磷酸化的改变是由RTK激活介导的，与G蛋白偶联受体（GPCR）途径无关。
　　结论
　　①胰岛素作用可使胰岛β细胞PLCγ1在30分钟内发生磷酸化改变。
　　②胰岛素作用可使βTC-3细胞PLCγ1在30分钟内表达明显减少，磷酸化水平明显升高，此效应是胰岛素通过RTK介导的。

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前言

文献回顾

1．胰岛素分泌特点及作用机制

2．β细胞是胰岛素作用的靶细胞

3. 胰岛素受体(IR)

4. 胰岛素受体底物(IRS)

5. 胰岛素介导的信号转导

6. 磷脂酶 C（PLC）

正 文

胰岛素对胰岛β细胞磷脂酶 Cγ1 及其磷酸化水平表达的影响

0 引言

第一部分

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

第二部分

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

讨 论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢