新中药成分在激光脑损伤保护及诱导胶质瘤细胞凋亡中的作用

摘要

激光致脑损伤是一种特殊类型的脑损伤,激光脑损伤的病理、生理变化特点目前尚不清楚，研究激光脑损伤的特点有重要意义。白藜芦醇是一种植物提取物，具有抗血小板聚集、抗炎、清除自由基、抗氧化及心血管保护等多种作用,但白藜芦醇是否对激光脑损伤具有神经保护作用仍不很清楚。海星皂甙-15是我国科学家自主分离获得的一种新的中药成分，它具有多种生物活性作用，包括溶血、抗病毒、抗肿瘤等，可其对胶质瘤增殖与分化的影响仍有待探索。本研究拟通过建立一种大鼠激光脑损伤模型，在明确激光脑损伤病理、生理变化的基础上，初步阐明白藜芦醇对激光脑损伤的保护作用机制；同时，体外培养胶质瘤细胞，探讨海星皂甙-15诱导胶质瘤细胞系U87MG细胞发生凋亡的分子机制，为临床利用新的中药成分治疗激光脑损伤和脑胶质瘤提供实验依据。
　　第一部分.白藜芦醇对大鼠激光脑损伤后神经保护作用的研究
　　激光武器是一种利用激光束摧毁飞机、导弹、卫星等目标并使其失效的定向能武器，是继核、电磁脉冲武器之外的另一种高能武器。这种武器产生的激光束具有快速、高能、穿透力极强等特点，可在瞬间穿透目标物体，将接触点汽化或熔解，从而对目标物体实现动能或热能性杀伤。高能激光武器在未来战争中的应用将会越来越普遍。激光武器对人的视力和肢体造成的损伤已有一些研究报道，但对颅脑损伤的研究则较少，因此，研究激光致颅脑损伤的特点具有重要意义。本研究以大鼠为实验动物，在建立一种稳定、可重复性激光脑损伤动物模型的基础上，检测大鼠激光脑损伤后的病理、生理变化，并探讨白藜芦醇作为激光脑损伤保护剂的作用，为战时激光颅脑损伤的救治提供实验理论依据。
　　实验一、大鼠激光脑损伤模型的建立及生理变化
　　目的：建立一种稳定、可靠的大鼠激光脑损伤动物模型。方法：成年SD大鼠100只，体质量220±30g，随机分为假手术组(n=25)和激光脑损伤组(n=75)；激光脑损伤组分别用14J、28J和56J能量激光照射致伤动物，根据伤后处理时间点每组再分为5个亚组，即伤后6h、24h、48h、72h和7d组，每亚组动物5只；假手术组不予激光照射。检测照射后不同时间点动物血压、脉搏、神经功能评分和脑水肿指数变化。结果：不同能量组伤后血压、脉搏、神经功能评分和脑水肿指数变化有所不同；假手术组则无明显改变。结论：工作距离0.5cm、工作电流0.2mA、波长10.64μm的28J能量激光可造成稳定的激光脑损伤动物模型。
　　实验二、大鼠激光脑损伤后的病理变化
　　目的：检测大鼠激光脑损伤后损伤区脑组织的病理变化特点，探讨激光脑损伤动物模型的特殊标记物。方法：成年雄性SD大鼠36只，体质量220±30g，随机分为对照组(n=6)和激光脑损伤组(n=30)；激光脑损伤组用工作距离0.5cm、工作电流0.2mA、波长10.64μm的28J能量激光照射而致伤动物，根据伤后处理时间点再分为5个亚组，即伤后6h、24h、48h、72h和7d组，每亚组6只动物；对照组不予激光照射。检测照射后不同时间点伤区脑组织HE、电镜病理形态变化，免疫组化法检测热休克蛋白70和小胶质细胞的表达。结果：激光照射后不同时间点伤区脑组织HE染色显示形态变化不同；电镜病理形态变化主要表现在以血管内皮细胞受损改变为主及血脑屏障受损改变；免疫组化显示热休克蛋白70表达不同；OX-42免疫组化显示小胶质细胞激活的数量及形态变化均有异；对照组无明显改变。结论：系统检测大鼠激光脑损伤后病理改变，揭示小胶质细胞可作为大鼠激光脑损伤的标记物。
　　实验三、白藜芦醇对大鼠激光脑损伤的神经保护作用
　　目的：检测大鼠激光脑损伤后生化指标改变，探讨白藜芦醇的神经保护作用。方法：成年SD大鼠55只，体质量220±30g，随机分为假手术组(n=5)、激光脑损伤组(n=25)和白藜芦醇治疗组(n=25)；激光脑损伤组和治疗组用28J能量激光照射致伤动物，根据伤后处理时间点每组再分为5个亚组，即伤后6h、24h、48h、72h和7d组，每亚组5只；假手术组不予激光照射。检测各组动物在白藜芦醇处理前后不同时间点神经行为学评分、脑水肿指数变化；并用氨基酸分析仪检测多种氨基酸的变化；放射免疫法检测血清炎性因子的改变；免疫印迹法检测热休克蛋白70的表达。结果：白藜芦醇治疗组神经行为学评分增加，脑水肿指数降低，兴奋性氨基酸水平下降，热休克蛋白70表达增多。结论：白藜芦醇可作为大鼠激光脑损伤有效的神经保护剂。
　　第二部分.海星皂甙-15通过线粒体途径诱导U87MG细胞凋亡的实验研究
　　脑胶质细胞瘤是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤，约占成人颅内肿瘤的40％～50％，其恶性度高，侵袭性很强，手术治疗后仍易复发；放疗和化疗虽然也有疗效，但患者总的预后仍无明显改善。目前,越来越多的学者开始致力于寻找对胶质瘤更有效的化疗药物研究，以期提高胶质瘤的治疗效果。海星皂甙-15是我国科学家从我国南海三亚海域面包海星中分离鉴定的、具有生物活性的一系列海星皂甙中的第15个，该化合物分子式为C45H74O22S2Na2,分子量为1076，系统命名：(20R,24S)-6a-O-[3-O-甲基-b-D-吡喃奎诺糖基-(1?2)-b-D-吡喃木塘基-(1?3)-b-D-吡喃葡萄糖基]-5a-胆甾-9(11)-烯-3b,24-二硫酸钠盐。已有研究表明它具有多种生物活性，包括溶血、抗病毒、抗肿瘤等，本研究利用人脑胶质母细胞瘤细胞系U87MG细胞研究海星皂甙-15在体外对肿瘤细胞的影响，探索其作用机理，以期为临床发现新的、更有效的抗肿瘤化疗药物。
　　目的：探讨面包海星提取物海星皂甙-15对人胶质母细胞瘤U87MG细胞的影响及可能作用机理。方法：体外培养人胶质母细胞瘤U87MG细胞，采用MTT实验检测海星皂甙-15对U87MG增殖的影响；DNALadder检测凋亡片段；透射电镜检测细胞和线粒体形态学改变；Hoechst33342和Tunel染色检测细胞核变化；流式细胞分析仪检测细胞凋亡、细胞周期及线粒体跨膜电位(△Ψm)的改变；Westernblot分析细胞色素C、Caspase-3蛋白表达的变化。结果：海星皂甙-15呈时间和剂量依赖性抑制U87MG细胞增殖，并诱导U87MG细胞凋亡，其作用在12h、24h、48h、72h的IC50分别为9.9、5.3、3.8、2.6μg/mL；海星皂甙-15引起线粒体结构损伤，出现线粒体嵴断裂、△Ψm下降、细胞色素C释放增多、Caspase-3蛋白活化。结论：海星皂甙-15能抑制U87MG细胞增殖并诱导细胞凋亡，通过线粒体损伤途径可能是其作用机理。
　　总结:
　　1、建立一种稳定、可重复的大鼠激光脑损伤动物模型，系统观测了大鼠激光脑损伤后血压、脉搏、神经行为学评分及脑水肿改变；透射电子显微镜观察了伤区脑组织的超微结构改变；免疫组化法检测伤后热休克蛋白70和小胶质细胞激活的时程及形态变化规律；探讨了白藜芦醇对大鼠激光脑脑损伤的神经保护作用，指出白藜芦醇可以作为大鼠激光脑损伤的神经保护剂。
　　2、体外培养人脑胶质母细胞瘤U87MG细胞，探讨不同浓度及作用时间海星皂甙-15对人脑胶质母细胞瘤U87MG细胞的影响。结果显示海星皂甙-15呈时间和剂量依赖性抑制人脑胶质母细胞瘤U87MG细胞增殖，并诱导U87MG细胞凋亡，线粒体损伤途径可能是其作用机理。

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缩略语表

中文摘要

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前言

文献回顾

一、激光在军事和医学中的应用

二、白黎芦醇的药理作用

三、脑胶质细胞瘤的药物治疗现状与进展

正文

第一部分. 白藜芦醇对大鼠激光脑损伤后神经保护作用的研究

实验一、大鼠激光脑损伤模型的建立及生理变化

实验二、大鼠激光脑损伤后的病理变化

实验三、 白藜芦醇对大鼠激光脑损伤的神经保护作用

第二部分. 海星皂甙-15 通过线粒体途径诱导U87MG 细胞凋亡的实验研究

1. 材料

2. 方法

3. 结果

4. 讨论

小结

参考文献

附图

个人简历和研究成果

致谢