酵母双杂交筛选IRE1结合蛋白及其在肝细胞凋亡中的作用研究

摘要

内质网跨膜蛋白需肌醇酶1（IRE1）是内质网应激（ERstress）的核心感受器，可感受内质网管腔内未折叠蛋白的聚集并将这种刺激传递至细胞其他区域。近年研究发现内质网应激与多种肝脏疾病有关，如病毒感染（乙肝、丙肝），糖尿病-肥胖症相关的肝脏疾病，酒精性肝病，α1-抗胰蛋白酶缺乏症及缺血再灌注损伤等。内质网应激引起的未折叠蛋白反应（UnfoldedProteinResponse,UPR）可通过诱导分子伴侣表达上调，关闭蛋白翻译等降低内质网蛋白负荷，但持续过强的内质网应激反应则导致细胞凋亡。为阐明内质网应激与肝细胞凋亡的关系，本研究通过酵母双杂交系统筛选与IRE1相互作用的蛋白质，为进一步探索内质网应激在肝脏疾病中的作用奠定基础。
　　1.酵母双杂交系统筛选IRE1相互作用蛋白质：采用酵母双杂交的方法，分别以hIRE1α(人IRE1α)N端段1～465位氨基酸及C端段468～977位氨基酸为诱饵，与人睾丸cDNA文库质粒顺序转化AH109酵母菌株，经三重/四重营养缺陷培养基及X-α-GAL半乳糖苷酶试验筛选，将PCR鉴定为阳性的酵母质粒转入大肠杆菌，提取质粒并测序，进行生物信息学分析。最后通过酵母回转杂交实验对获得的相互作用加以验证。结果：成功构建诱饵质粒pGBKT7-IRE1N及pGBKT7-IRE1C，并在酵母中正确表达融合蛋白，自激活检测及毒性检测均为阴性。分别筛选出8个及15个与IRE1相互作用的蛋白质；通过回转实验验证，确定了能与IRE1C端段相互作用的蛋白质RACK1。RACK1是由SCOTIN基因编码的支架蛋白，可细胞内多种激酶相互作用，介导激酶与底物的结合。
　　2.验证IRE1与RACK1在哺乳动物细胞及体外的相互作用：（1）构建真核表达载体3XFLAG-IRE1C,GFPC3-RACK1,双酶切及测序鉴定正确，以GFPC3空载体作为对照，共同转染293T细胞，利用免疫共沉淀技术验证IRE1与RACK1在哺乳动物细胞中的相互作用。（2）构建原核表达载体pGEX-6p2-RACK1,pGEX-6p1-IRE1C，分别转化大肠杆菌BL21，IPTG诱导融合蛋白表达并纯化，其中以precision酶切GST-RACK1融合蛋白，获得不带GSTTAG的RACK1蛋白，与空GST蛋白为对照，分别与GST-IRE1C孵育，体外Pull-down实验验证IRE1与RACK1的相互作用。（3）构建真核表达质粒GFPC3-IRE1WT，转染人肝癌细胞系HepG2,同时以RACK1单抗及抗鼠-Rodamine为二抗进行免疫荧光实验，检测IRE1及RACK1在肝细胞中的定位。结果：通过体内及体外实验分别验证IRE1与RACK1相互作用的存在，且证明IRE1C端为RACK1结合部位，免疫荧光证实IRE1与RACK1在肝细胞内有共定位，为其相互作用提供可靠依据。
　　3.RNA干扰实验探讨RACK1对IRE1功能的影响：（1）转染RACK1SiRNA入HepG2细胞，48小时后收取细胞裂解液，进行Westernblot验证基因敲除效果。给予敲除RACK1的细胞以内质网应激诱导药物衣霉素（Thapsigargin,TG）处理，通过westernblot检测IRE1的磷酸化及其下游内质网分子伴侣GRP78的表达，同时应用RT-PCR检测XBP-1mRNA的表达及其剪切，确定RACK1敲除对IRE1功能的影响。（2）相同方法敲除HepG2细胞中RACK1的表达，给予不同剂量的TG处理，TUNEL法检测RACK1敲除对内质网应激时肝细胞凋亡的影响。结果：成功敲除HepG2细胞中RACK1的表达，Westernblot及RT-PCR证实RACK1敲除可抑制内质网应激时IRE1的功能活化，同时抑制内质网应激对肝细胞凋亡的诱导。
　　结论：本研究通过酵母双杂交系统首次发现IRE1与RACK1的相互作用，并通过体内、体外多种方法证实其相互作用的存在，最后通过RNA干扰及功能试验证实IRE1对ERstress的感受及活化，对分子伴侣的诱导及XBP-1的剪切，以及细胞凋亡的诱导，均依赖于RACK1的存在，提示RACK1是内质网应激反应信号通路中不可或缺的一个环节，与ERstress下肝细胞的凋亡密切相关，进一步的研究对内质网应激相关的肝脏疾病有重要意义。

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缩略语表

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前言

文献回顾

一 内质网应激反应与细胞凋亡

二 内质网应激与肝脏疾病

正文

实验一：酵母双杂交筛选IRE1 相互作用蛋白

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二：在体外及哺乳动物细胞内验证IRE1 与RACK1 的相互作用

1 材料

2.方法

3 结果

4 讨论

实验三：RNAi技术敲除RACK1 表达对IRE1 功能的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

附录

个人简历和研究成果

致谢