大鼠骨髓间充质干细胞分化的心肌样细胞与心肌成纤维细胞移植治疗功能性室壁瘤的研究

摘要

一﹑研究背景及目的
　　室壁瘤是心肌梗死的严重并发症之一，是由于心肌细胞坏死和胶原纤维受损，室壁无法抵抗心室收缩时的强大张力，从而向外膨出造成的，其主要并发症为附壁血栓、室性心律失常、顽固性充血性心力衰竭和心脏破裂等。室壁瘤在心肌梗死患者中的发生率高达10％～38％。未治疗患者5年存活率为47％[1-3]，10年存活率仅为18％。目前对室壁瘤的主要治疗手段是外科手术，但其仅适于晚期解剖性室壁瘤，对于功能性室壁瘤虽可利用药物治疗改善心功能和防治并发症，但不能挽救已受损坏死心肌。近年来，骨髓间充质干细胞(BMMSCs)由于具有取材方便，无免疫排斥性，增殖能力强，多向分化潜能等优势，而成为修复和重建心肌的研究热点。应用BMMSCs治疗心肌梗死、缺血性心脏病等初见成效，显示了广阔的临床治疗前景。而应用干细胞移植治疗功能性室壁瘤是否具有可行性，是否能够促进室壁瘤的修复，改善心功能，目前国内外尚未见相关报道。
　　本研究旨在通过观察移植BMMSCs分化的心肌样细胞和心肌成纤维细胞(CFs)对大鼠功能性室壁瘤的修复作用和心功能的影响，为临床应用细胞移植治疗功能性室壁瘤提供研究依据。
　　二﹑研究方法
　　1.BMMSCs的培养、诱导及诱导后鉴定：依据密度梯度离心法体外分离、培养大鼠BMMSCs，待细胞传至3代，加入终浓度为10μmol/L的5-氮杂胞苷(5-aza)培养24h后，继续常规培养，4w后细胞用肌钙蛋白I(cTnI)鉴定。
　　CFs的培养及鉴定：采用酶消化法和差速贴壁法结合的方法，培养乳鼠CFs，并用I型胶原蛋白鉴定。
　　2.制备动物模型：结扎大鼠冠状动脉前降支，结扎后左室室壁变苍白，心电监护可见R波振幅升高，表明结扎成功；4w后，超声心动图可见左室收缩和舒张末期内径(LVESD、LVEDD)增大，短轴缩短率(FS)及射血分数(EF)均降低。前间隔和前壁局部变薄，回声增强，收缩功能均不同程度减弱或消失。室壁瘤部位表现为前壁及心尖部有隆起结构，并和心室壁有连续性。
　　3.分组：造模成功大鼠随机分为4组(n=10)。①对照组，注射生理盐水(100μL)；②ClCs组，移植心肌样细胞(4×106～5×106/100μL)；③CFs组，移植CFs(4×106～5×106/100μL)；④Comb组，移植心肌样细胞和CFs(4×106～5×106/100μL，1：1混合)。移植前，分别用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)和羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)标记心肌样细胞和CFs，随后通过开胸直视，用微量注射器将各组细胞多点注射到室壁瘤部位及周边，
　　4.细胞移植后评价：移植4w后，用超声心动图和血流动力学方法大鼠测定心功能相关指标，用荧光显微镜观察标记的细胞，并通过Masson氏三色染色法测定室壁瘤范围。
　　三﹑结果
　　1.BMMSCs接种于培养瓶24h后，倒置显微镜下可见瓶底有少量细胞贴壁，体小而圆，浆少核大。3～4d后细胞呈集落样生长，为不规则形、短梭形或多角形，之后渐变为均匀的纺锤形、梭形，排列紧密。5-aza诱导后，细胞逐渐变大、变长，形态不规则，2w后互相融合，形成肌管样结构，3w后肌管样结构增多，细胞走行趋向一致。4w后，细胞cTnI荧光染色阳性。
　　CFs贴壁和生长迅速，2～3d可呈融合状态，细胞排列紧密，呈梭形，胞体和胞核较大，胞浆透明，无自发性搏动。2w后，细胞I型胶原蛋白免疫荧光染色阳性。
　　2.细胞移植4w后，超声心动图结果显示：与对照组相比，移植ClCs、CFs或Comb组移植均可降低功能性室壁瘤的LVEDD与LVESD[(8.749±0.091)mm、(8.587±0.481)mm、(8.131±0.130)mmvs(9.299±0.064)mm，P＜0.05；(5.109±0.171)mm、(4.991±0.054)mm、(4.682±0.089)mmvs(5.898±0.122)mm，P＜0.05]，且联合移植的降低程度大于单一细胞移植(P＜0.05)。此外，移植ClCs或联合移植均可显著增高FS及EF[(32.70±1.283)％、(33.37±0.417)％vs(22.21±0.339)％，P＜0.05；(45.78±1.796)％、(47.22±0.594)％vs(31.09±0.475)％，P＜0.05]。
　　3.血流动力学结果显示：与对照组相比，移植ClCs或联合移植可明显改善功能性室壁瘤的LVDP、(+dp/dtmax)和(-dp/dtmax)(152.9±0.669)mmHg、(163.7±2.142)mmHgvs(122.5±2.639)mmHg，P＜0.05；(4109±33.86)mmHg/s、(4076±29.37)mmHg/svs(3223±73.50)mmHg/s，P＜0.05；(-3579±49.09)mmHg/s、(-3708±54.91)mmHg/svs(-2828±60.96)mmHg/s，P＜0.05]，然而，移植CFs后无明显改善(P＞0.05)。
　　4.Masson氏法染色结果显示：与对照组相比，移植ClCs、CFs或两种细胞联合移植均可显著降低室壁瘤范围[(22.20±0.64)％、(22.11±0.77)％、(19.59±0.61)％vs(25.74±1.13)％，P＜0.05]，且联合移植的降低幅度最为明显(P＜0.05)。
　　5.荧光显微镜下可在ClCs组的细胞移植区观察到有DAPI标记的心肌样细胞；CFs组有CFSE标记的CFs绿色荧光的表达；Comb移植组可同时观察到这两种细胞，荧光细胞呈簇状分布，细胞核形态相对规则。
　　四﹑结论
　　1.BMMSCs易于在体外分离、培养和扩增，经5-aza诱导后，可向心肌方向分化，表达心肌特异性蛋白—cTnI。
　　2.酶消化法和差速贴壁法结合能成功并高效地培养表达I型胶原蛋白的CFs。
　　3.细胞移植4w后，心肌组织中观察到DAPI和CFSE标记的细胞，证明移植的细胞可在心肌中存活。
　　4.心肌样细胞联合CFs移植能够改善功能性室壁瘤的进一步重构，提高大鼠的心功能。

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缩略语表

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前言

文献回顾

一、BMMSCs 向心肌细胞分化的研究

二、BMMSCs 与心血管疾病

三、CFs 与心室重构

四、CFs 与分子性心肌成形术

正文

第一部分 心肌样细胞和心肌成纤维细胞的培养及鉴定

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分 心肌样细胞联合心肌成纤维细胞移植治疗功能性室壁瘤的研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小 结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢