转录相关增强子-1在压力负荷心肌肥厚中的作用血管内皮生长因子B的关键作用

摘要

目的:转录相关增强子-1(related transcriptional enhancer factor-1, RTEF-1)隶属于转录增强子家族,主要在肌细胞中表达,它可与肌肉特异性基因启动子M-CAT序列结合并调节这些基因的表达。在内皮细胞中,RTEF-1可与血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A, VEGF-A)基因启动子的刺激蛋白1(stimulating protein1, SP1)序列结合并调节其表达。然而, RTEF-1在内皮中转录调控的分子类别、功能尚不明确。为了进一步明确RTEF-1在内皮细胞中的功能,尤其是它在病理性心肌肥厚中发挥的效应,我们设计并构建了血管内皮特异性RTEF-1过表达转基因小鼠以及RTEF-1过表达的内皮细胞,并观察它们在生理以及病理刺激条件下的改变及其效应,旨在阐明内皮细胞在病理性心肌肥厚的可能效应及其机制。
　　方法:1)血管内皮细胞特异性RTEF-1过表达转基因小鼠(VE-Cad/RTEF-1)的建立;2)主动脉缩窄术(transverse aortic constriction, TAC)及其评价;3)心肌细胞大小以及心脏血管密度检测;4)细胞培养;5)反转录病毒感染以及干扰性小核糖核酸(small interfering ribonucleic acid, siRNA)转染;6)双荧光素酶启动子活性测定和染色质免疫沉淀;7)信使RNA(messenger RNA, mRNA)分析和蛋白印迹。
　　结果:1) VE-Cad/RTEF-1小鼠的建立:基因型鉴定、心脏和原代心脏内皮细胞蛋白印记结果证实RTEF-1基因被导入小鼠基因组中,并在心脏以及心脏分离的内皮细胞中特异性过表达。2) VE-Cad/RTEF-1小鼠压力负荷刺激后的心脏改变:主动脉绑扎术后8周,与野生型(wild type, WT)小鼠相比,VE-Cad/RTEF-1小鼠发生更明显的心肌肥厚,表现为心脏胫骨比(heart weight/ tibia bone length, HW/TBL)的增加(WT9.3±0.5 mg/mm v.s. VE-Cad/RTEF-110.9±1.0 mg/mm)、心肌细胞横截面积的增大(WT242.8±5.6μm2 v.s. VE-Cad/RTEF-1293.6±4.7μm2)、左室壁的增厚(WT0.80±0.01 mm v.s. VE-Cad/RTEF-10.88±0.03 mm),以及心肌肥厚基因标志物表达的增加,同时伴有更显著的血管内皮生长因子B(vascular endothelial growth factor B, VEGF-B)的表达增加和细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase1/2, ERK1/2)的磷酸化。3) RTEF-1过表达的人真皮微血管内皮细胞(HMEC-1/RTEF-1)及其VEGF-B的表达:蛋白印记实验证实RTEF-1在HMEC-1中稳定表达。在常氧条件下,HMEC-1/RTEF-1细胞及其培养液中的VEGF-B表达水平较其对照组细胞( HMEC-1/pBMN)明显增加,而缺氧后HMEC-1/RTEF-1细胞及其培养液的VEGF-B表达水平增加更为明显。基因沉默HMEC-1细胞中的RTEF-1后,其VEGF-B表达水平明显下降。4) RTEF-1调节VEGF-B启动子活性:双荧光素酶启动子活性和染色质免疫沉淀实验表明,通过与M-CAT元件结合,RTEF-1可上调约1.5~1.8倍的VEGF-B启动子活性,而缺氧时RTEF-1对VEGF-B启动子的转录调节作用被进一步加强。5) VEGF-B促心肌肥厚效应:缺氧处理RTEF-1过表达的内皮细胞或重组人VEGF-B167(human recombinant VEGF-B167)孵育心肌细胞后,可显著上调心肌细胞中心肌肥厚基因标志物的表达水平,VEGF-B特异性siRNA可显著抑制RTEF-1过表达的内皮细胞中VEGF-B的表达,并继而降低其约75％的促心肌肥厚效应。免疫组化结果表明rhVEGF-B167可诱导NRVMs发生明显的肥大。6) VEGF-B促心肌肥厚的信号转导机制:重组人VEGF-B167可使NRVMs的ERK1/2发生明显的磷酸化。ERK1/2特异性阻断剂U0126可部分或完全的阻断rhVEGF-B167诱导的ERK1/2磷酸化及其促心肌肥厚效应。
　　结论:1)主动脉缩窄术诱导的心脏后负荷增加可使内皮特异性过表达RTEF-1小鼠发生更明显的左心室心肌肥厚。2)内皮特异性过表达RTEF-1通过调节VEGF-B启动子M-CAT元件活性,上调内皮细胞VEGF-B的表达,继而激活心肌细胞ERK1/2信号系统,从而发挥促心肌肥厚作用。这些结果提示了内皮细胞通过RTEF-1调控VEGF-B的生成,参与了心肌肥厚的发生,揭示了在病理性心肌肥厚过程中,内皮细胞对心肌细胞的直接调控作用。

目录

缩略语表

中文摘要

ABSTRACT

前言

文献回顾

正文

实验一 血管内皮特异性 RTEF-1 过表达转基因小鼠的建立、鉴定及其在压力负荷下的心脏变化

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

实验二 RTEF-1 转录调节血管内皮生长因子B的表达及其可能机制

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

实验三 RTEF-1 诱导的VEGF-B的促心肌肥厚效应及其关键信号分子

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢