鱼肠道弧菌单克隆抗体的制备及应用

摘要

利用鱼肠道弧菌作为病原菌免疫新西兰大白兔，获得免疫抗血清，建立了间接免疫荧光抗体技术（indirect immunofluorescence assay test，IFAT）和Western-blotting免疫印迹技术。免疫荧光阳性结果显示可观察到呈绿色荧光的菌体，该菌体两端钝圆，弧形短杆状与鱼肠道弧菌菌体形态相一致，而阴性对照组无荧光信号显示。用鱼肠道弧菌抗血清进行Western-blotting免疫印迹，结果表明共有10条蛋白带发生了免疫反应，分子量分别为102.94KDa、88.243KDa、79.262KDa、72.731KDa、61.835KDa、36.538KDa、34.571KDa、29.571KDa和18.136KDa条蛋白带。其中88.243KDa、79.262KDa、72.731KDa、61.835KDa、42.692KDa和18.136KD共6条蛋白带较为清晰，显示出较强的特异性免疫反应，而阴性对照组无任何条带显示[98]。从而为鱼肠道弧菌的检测提供了一种可行、快速的检测方法。 以鱼肠道弧菌（Vibrio ichthyoenteri)为抗原，制备抗鱼肠道弧菌多克隆抗体，进而建立了此菌的间接酶联免疫吸附检测技术(Enzyme Linked ImmunosorbentAssay，ELISA)。该方法最佳反应条件为:抗原包被浓度为为107 cfu/mL，免疫血清稀释度为1∶211。病原菌检测灵敏度为每孔105 cfu/mL。抗血清与迟钝爱德华氏菌、杀鲑气单胞菌、弧菌等8种水产致病菌的交叉反应结果呈阴性。用该法检测人工感染后的牙鲆和健康牙鲆，在发病鱼的肝、肾、脾、腹水等处检测出病原菌而健康鱼则为阴性，准确率为95％。说明该技术能够准确、快速检测出鱼肠道弧菌。 以鱼肠道弧菌为抗原免疫小鼠，采用PEG方法进行细胞融合，间接免疫荧光抗体技术和酶联免疫吸附检测技术两种方法筛选确认阳性杂交瘤细胞株，取两种方法检测均为阳性的细胞株进行亚克隆，获得分泌抗鱼肠道弧菌抗体的单克隆细胞株(1C6、1D8、2D7、2D10、2E3)，免疫印迹(Western blotting)结果显示单抗2D10与分子量为44.2 KDa，36.7 KDa的鱼肠道弧菌蛋白发生特异性结合;流式细胞技术(Flow Cytometry，FCM)结果显示阳性荧光比例为13.63％，阴性对照荧光比例不足1％。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 鱼类弧菌病研究概况

1．2 鱼肠道弧菌的致病性

1．2．1 牙鲆的全身性败血症感染

1．2．2 红鳍东方鲀组织性溃烂与出血感染

1．3 致病因子

1．3．1 外膜蛋白

1．3．2 脂多糖

1．3．3 外毒素

1．3．4 鞭毛抗原

1．3．5 菌毛抗原

1．4 诊断和防治方法的研究

1．4．1 间接免疫荧光检测技术

1．4．2 间接ELISA检测技术

1．4．3 Western免疫印迹技术

1．4．4 流式细胞技术

1．5 水产致病菌单抗的研究现状

2 鱼肠道弧菌间接免疫荧光技术和免疫印迹技术的建立

2．1 材料与方法

2．1．1 实验材料

2．1．2 抗原制备

2．1．3 抗血清制备

2．1．4 抗血清的纯化及效价测定

2．1．5 间接免疫荧光检测方法

2．1．6 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳

2．1．7 Western-blotting免疫印迹

2．2 结果

2．2．1 IFAT检测结果

2．2．2 鱼肠道弧菌电泳结果

2．2．3 Western-blotting免疫印迹结果

2．3 讨论

3 鱼肠道弧菌间接ELISA快速检测法的建立

3．1 材料与方法

3．1．1 实验材料

3．1．2 抗原制备

3．1．3 抗血清制备

3．1．4 抗血清的纯化

3．1．5 ELISA方法的建立

3．1．6 抗原最适包被浓度的确定

3．1．7 免疫血清最适稀释度的确定

3．1．8 免疫血清敏感性实验

3．1．9 人工感染实验的ELISA检测

3．2 结果

3．2．1 抗原最适包被浓度

3．2．2 免疫血清最适稀释度

3．2．3 免疫血清敏感性实验

3．2．4 鱼肠道弧菌ELISA检测的应用

3．3 讨论

4 鱼肠道弧菌单克隆抗体的制备

4．1 试验材料

4．2 单抗的制备过程

4．2．1 抗原的制备

4．2．2 免疫Balb／C小鼠

4．2．3 SP2／0细胞复苏和传代培养

4．2．4 免疫小鼠脾细胞与SP2／0细胞融合

4．2．5 细胞融合后的观察与换液

4．3 阳性杂交瘤细胞的筛选与克隆

4．3．1 阳性杂交瘤细胞的筛选

4．3．2 有限稀释法克隆阳性杂交瘤细胞

4．4 单克隆抗体的应用

4．4．1 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳

4．4．2 电转移

4．4．3 免疫印迹

4．4．4 流式细胞技术

4．4．5 特异性实验

4．4．6 人工感染实验的检测

4．5 结果

4．5．1 杂交瘤细胞株的建立

4．5．2 ELISA检测结果

4．5．3 IFAT检测结果

4．5．4 SDS-PAGE与Western blotting结果

4．5．5 FCM检测结果

4．5．6 特异性实验结果

4．5．7 牙鲆组织中鱼肠道弧菌检测结果

4．6 讨论

参考文献

附录

致谢