外源性脆性三联组氨酸蛋白Fhit对结肠癌和肝癌细胞增殖和凋亡生物学功能的影响及分子机制研究

摘要

脆性三联组氨酸基因Fhit（Fragile histidine triad gene）是1996年发现的一种新的肿瘤抑制基因，属于三联组氨酸家族，编码1.1Kb的mRNA，翻译为16.8KD的蛋白。研究表明，Fhit表达的降低和缺失与恶性肿瘤的发生发展密切相关。在对乳腺癌，肺癌，胃癌，前列腺癌，胃肠道肿瘤，头颈部肿瘤等恶性肿瘤的研究中，都发现了Fhit转录本或是蛋白表达的改变。以腺病毒或腺相关病毒为载体携带Fhit基因对某些肿瘤如胃癌、肺癌、头颈部肿瘤、食管癌等进行的基因替代和补充治疗能够促进肿瘤细胞的凋亡，抑制了肿瘤的发生发展。虽然Fhit发挥了抑癌基因的作用，但其发挥作用的具体分子机制依然不明确。在研习文献的过程中，我们发现关于Fhit与结肠癌和肝癌的研究相对较少，而在为数不多的几篇相关报告中，只有少量数据提示Fhit可能在上述两种肿瘤的临床标本中存在表达降低，其是否具有治疗学价值尚未被证实。所以，研究Fhit对于结肠癌和肝癌细胞的肿瘤抑制作用能够进一步的阐明Fhit抑癌基因功能，为Fhit的基因治疗提供实验依据。也为进一步研究Fhit抑制肿瘤发生发展的作用机制打下了一定的基础。
　　在本研究的第一部分实验中，我们通过复制缺陷型重组腺病毒介导的方式将Fhit在结肠癌细胞中重新表达，研究其对结肠癌细胞增殖能力的影响，并初步探讨其对肿瘤生长抑制的分子机制。在本研究的第二部分实验中，我们构建了含有TAT转位肽和Fhit分子融合蛋白表达基因。在BL21大肠杆菌中表达、纯化后，对纯化产物的内化活性及生物学功能在肝癌细胞中进行了研究。为了对Fhit抑癌机制进行初步的探讨，在本研究的第三部分实验中，我们利用酵母双杂交系统在胎肝文库中钓取可能与Fhit发生直接相互作用的蛋白质分子，并初步筛选到一个可能与Fhit相互结合的蛋白质分子，更进一步的相互作用验证实验和其相互作用的生物学意义是我们下一步的研究计划。
　　实验一：我们利用PCR方法从人胎肝文库中克隆Fhit基因片段，Fhit基因PCR产物连入T载体构建重组质粒pMD18T-Fhit。测序正确后，将基因片段导入pTrack-CMV穿梭质粒中，构建重组穿梭载体pTrack-CMV-Fhit。将经PmeⅠ单酶切线性化的pTrack-CMV-Fhit和骨架腺病毒质粒pAdEasy-1共转BJ5183大肠杆菌，使pTrack-CMV-Fhit和pAdEasy-1发生同源重组。经PacI酶切鉴定正确后,将重组腺病毒质粒转染293A细胞获得表达Fhit蛋白的重组腺病毒rAd-Fhit，将获得的重组腺病毒感染结肠癌细胞，在利用Westernblot法确认外源Fhit蛋白在结肠癌细胞中表达的基础上，使用MTT法检测rAd-Fhit对结肠癌细胞增殖能力的影响，并利用Weaternblot分析Fhit对经典Wnt信号通路和ERK信号通路的可能影响。实验结果显示，我们成功构建了携带有Fhit基因的重组腺病毒，且能够在结肠癌细胞中成功表达Fhit蛋白。在结肠癌细胞中，Fhit蛋白明显减弱了结肠癌细胞的增殖能力。Fhit分子对结肠癌细胞增殖的抑制作用部分是通过经典Wnt信号通路的激活和ERK信号通路的失活来实现的
　　实验二：我们设计引物扩增Fhit基因，人工合成TAT转位肽蛋白基因，两者连接成TAT-Fhit融合表达基因片段。将获得的基因片段克隆入原核表达载体pET32a，同时设未连接TAT转为肽的Fhit为对照，在大肠杆菌BL21中诱导表达，表达产物经SDS-PAGE鉴定后，用Ni-NTA螯合层析介质纯化。间接免疫荧光检测融合蛋白的内化活性，流式细胞计数检测细胞凋亡，MTT检测观察融合蛋白对细胞增殖能力的影响。通过本部分实验，我们构建了含有TAT转位肽和Fhit基因的融合蛋白原核表达载体，在BL21细菌中成功表达融合蛋白。在确认蛋白可溶性表达的基础上，利用Ni-NTA螯合层析介质纯化Fhit和TAT-Fhit蛋白。间接免疫荧光检测提示融合蛋白可内化入肝癌细胞，并能抑制肝癌细胞增殖，促进肝癌细胞凋亡。
　　实验三：我们通过酵母双杂交技术将构建好的Fhit诱饵蛋白和胎肝质粒文库共转化酵母AH109菌株，通过在营养缺陷型培养基上高严谨性筛选阳性克隆，提取阳性克隆中的质粒，经DH5α大肠杆菌扩增后进行酶切分析，将不同带型的质粒测序后进行生物信息学分析，寻找能与Fhit相互作用的蛋白。通过这种经典研究蛋白相互作用的方法，我们筛选到一个可能与Fhit相互作用的蛋白即动力蛋白轻链1（Dyneinlightchain1,DYNLT1），但两者是否具有直接相互作用，以及其相互作用的生物学意义尚需进行更进一步的研究方能确认。
　　综上所述，在结肠癌细胞中，Fhit基因可能扮演抑癌基因的角色，而表达Fhit的重组腺病毒很可能成为一种结肠癌生物治疗的新策略。Fhit基因与TAT转位肽融合后，能在TAT转位肽的介导下通过细胞膜进入肝癌细胞，发挥Fhit抑癌基因的作用，抑制肝癌细胞的增殖，促进其凋亡，为利用TAT转位肽作为一种新的肿瘤治疗策略奠定了实验基础。Fhit可能与和DNTLY1相互作用，通过影响动力蛋白对细胞内物质的运输和调节影响细胞状态，为探讨Fhit肿瘤抑癌机制提供了一定的实验依据。

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文献回顾

一、Fhit 的研究进展

二、重组腺病毒在肿瘤治疗中的应用

三、 蛋白转运结构域的研究进展

正 文

实验一 Fhit 表达重组腺病毒的构建表达及其在结肠癌细胞中的生物学功能

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨 论

实验二 融合蛋白TAT-Fhit 的构建、表达、纯化及其在肝癌细胞中的生物学功能

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨 论

实验三 酵母双杂交技术筛选 Fhit 的相互蛋白预实验

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

小 结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢