癌钙调蛋白/鱼精蛋白截短体融合蛋白的基因构建与表达

摘要

背景：
　　癌钙调蛋白(omcomodulin,OM)是二十世纪七十年代末Macmanus从大鼠肝癌组织中提取出的一种小分子蛋白，有研究表明OM有促进神经生长的作用，并且有加大神经生长因子促进视神经生长的作用。
　　目的：
　　体外拼装癌钙调蛋白(OM)/鱼精蛋白截短体（tp）融合基因,将其克隆至原核表达载体pET22b,并在大肠杆菌BL21中诱导表达癌钙调蛋白/鱼精蛋白截短体融合蛋白。
　　方法：
　　从大鼠腹腔巨噬细胞中提取细胞的总RNA，设计引物扩增癌钙调蛋白基因，并在其3’端引入鱼精蛋白截短体（tp）的编码基因，经PCR扩增获得OM/tp融合基因，将目的基因克隆至中间载体PUC57中,提取质粒PUC57-OM/tp,并测序鉴定。将克隆后的基因亚克隆至原核表达载体pET22b中,提取质粒PET22b-OM/tp,测序鉴定。质粒构建成功后，在大肠杆菌BL21中化学诱导表达，表达产物经过SDS-PAGE及Western-blot验证。
　　结果：
　　琼脂糖凝胶电泳获得目的基因（OM/tp），大小与预期的目的基因大小一致，目的基因克隆后，菌检PCR获得长度在500bp左右的阳性克隆,与预期大小一致。抽提质粒酶切后与载体PET22b连接转化大肠杆菌感受态细胞DH5a，菌检PCR获得长度在500bp左右OM/tp的阳性克隆，与预期大小一致。抽提质粒PET22b-OM/tp,经测序后与预期的序列一致。不同浓度的IPTG诱导表达后，细菌裂解上清中均出现大小约为18.4kDa的新生蛋白带，与预期的大小相符，光度扫描分析显示目的蛋白表达量占上清蛋白的43.4％。两种诱导浓度对蛋白表达量影响不明显，经过Western—blot分析证实，该条带为带有6-His标签的OM/tp融合蛋白，提示OM/tp融合蛋白表达成功，且以可溶性表达为主。
　　结论：
　　成功获得OM/tp融合基因,并在大肠杆菌中成功诱导表达OM/tp融合蛋白,为该融合蛋白促进视神经损伤后再生的研究奠定了基础。

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缩略语表

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英文摘要

前 言

文献回顾

一、癌钙调蛋白研究进展

二．融合蛋白在生物治疗中的应用

正 文

实验材料

第一部分 癌钙调蛋白/鱼精蛋白截短体融合蛋白基因在原核表达载体中的构建及鉴定

实验方法

实验结果

第二部分 癌钙调蛋白/鱼精蛋白截短体融合蛋白的表达

实验方法

实验结果

讨 论

小 结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢