γ-分泌酶抑制剂对人卵巢癌细胞生物学行为的影响及其机制的研究

摘要

卵巢癌是发生于卵巢组织的恶性肿瘤，占所有妇科恶性肿瘤的15％左右，仅次于宫颈癌，而其死亡率却位居第一位。卵巢癌有起病隐匿、早期不易发现、易转移、预后差等特点，所以卵巢癌患者5年生存率较低，成为严重威胁妇科肿瘤患者生命的恶性疾病。因此探讨卵巢癌的发生机制、寻找新的研究靶点、为肿瘤基因治疗提供新思路无疑具有十分重要的意义。
　　Notch信号途径作为一种古老而保守的信号通路，其通过影响细胞凋亡、增殖、分化等多效性作用的信号途径调节多细胞动物的形态发育和形成。目前研究证实其不但在组织的发生发展过程中有重要作用，且与肿瘤的发生发展有着密切关系，在人类许多实体瘤(如宫颈癌、子宫内膜癌、肾癌、肺癌、乳腺癌、胸膜间皮瘤和涎腺肿瘤)及血液系统肿瘤中有异常表达。有研究表明活化的Notch1及其下游基因HES1在卵巢腺癌中的表达明显高于在卵巢腺瘤及正常卵巢组织中的表达，表明Notch1与卵巢癌的发生有关。
　　γ-分泌酶是一包括PS二聚体、Nicastrin、PEN-2等组分的多酶复合体。γ-分泌酶剪切APP、Notch、E-cadherin、ErbB-4受体酪氨酸激酶等膜蛋白，研究表明γ-分泌酶抑制剂对多种细胞的生长具有抑制作用。本实验应用实时RT-PCR技术检测Notch1在不同卵巢癌细胞系中的表达，筛选出Notch1相对表达量较高的卵巢癌细胞株，应用γ分泌酶抑制剂阻断Notch信号通路，观察抑制Notch1表达对人卵巢癌细胞生物学行为的影响，探讨Notch1在卵巢癌细胞生长增殖、黏附及侵袭转移中的作用，为卵巢癌的治疗提供一种新思路。
　　【研究目的】
　　1.筛选高表达Notch1基因的人卵巢癌细胞株。
　　2.初步研究γ-分泌酶抑制剂对人卵巢癌细胞的生长、增殖、黏附、侵袭及迁移活性的影响，以及其对细胞周期分布的影响，并探讨其作用机制。
　　【方法及结果】
　　本研究分为二部分。
　　第一部分：γ-分泌酶抑制剂对人卵巢癌细胞生长及增殖的影响
　　方法：
　　1.采用实时PCR技术筛选高表达Notch1基因的人卵巢癌细胞株。
　　2.MTT试验及细胞集克隆试验检测细胞生长及增殖情况。
　　3.流式细胞仪检测细胞周期分布。
　　结果：
　　1.在A2780细胞中Notch1的相对表达量最高，为45.68。
　　2.γ-分泌酶抑制剂能抑制A2780细胞生长，并呈时间和剂量依赖性。
　　3.γ-分泌酶抑制剂能抑制A2780细胞的增殖，使细胞克隆形成率下降（p＜0.001）。
　　4.γ-分泌酶抑制剂使A2780细胞的G1期延长，细胞大部分停滞于此期，具有时间依赖性（p＜0.001）。
　　第二部分：γ-分泌酶抑制剂对人卵巢癌细胞黏附、侵袭及迁移活性的影响方法：
　　1.用γ-分泌酶抑制剂（DAPT）阻断Notch信号，实时RT-PCR检测Notch1及HES1在基因水平的表达情况
　　2.Westernblot试验检测Notch1及HES1在蛋白水平的表达情况。
　　3.MTT法检测细胞黏附能力的改变。
　　4.Transwell实验观察细胞侵袭转移情况。
　　5.细胞免疫荧光试验检测HES1在人卵巢癌细胞中的定位及表达情况。
　　结果：
　　1.DAPT作用后，Notch1及HES1在基因及蛋白水平的表达均被抑制，表达量下降呈时间依赖性，差异有统计学意义（p＜0.001）。
　　2.DAPT作用后，A2780细胞的黏附、侵袭及转移活性下降，呈时间依赖性（p＜0.05）。
　　3.HES1在人卵巢癌细胞中主要以核表达为主，也有少量的胞浆表达；DAPT作用后，HES1在人卵巢癌细胞中的表达下降，且主要集中于核表达，表达下降情况呈时间依赖性。
　　【结论】
　　1.γ-分泌酶抑制剂能够抑制A2780细胞的生长及增殖。
　　2.Notch信号通路被抑制后，Notch1的表达下降，A2780细胞的细胞周期主要停滞于G1期，提示Notch1在卵巢癌细胞周期调节中有重要作用。
　　3.抑制Notch1基因的表达能够抑制卵巢癌A2780细胞的黏附、侵袭及转移活性，说明Notch1在人卵巢癌细胞的黏附、侵袭及转移过程中发挥重要作用，且其机制可能与HES1的下调有关。
　　4.γ-分泌酶抑制剂能够改变HES1在人卵巢癌细胞中的表达及定位，并对其表达有抑制作用。
　　5.Notch信号通路可作为卵巢癌治疗的有效靶点，γ分泌酶抑制剂可能成为卵巢癌治疗的一种新药。

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缩略语表

中文摘要

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前言

文献回顾

一．肿瘤的生长与扩散

二．γ-分泌酶的研究进展

第一部分γ-分泌酶抑制剂对人卵巢癌细胞生长及增殖的影响

1 材料

2 方法

3 结果

第二部分γ-分泌酶抑制剂对人卵巢癌细胞黏附、侵袭及迁移活性的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

附录

致谢