Toll样受体4信号通路在心肌微血管内皮细胞缺氧复氧损伤中的作用研究

摘要

实验背景及目的：
　　心肌缺血再灌注损伤(myocardiumischemia/reperfusioninjury,MIRI)是冠心病心肌梗死溶栓和介入治疗的重要病理生理过程。失控的炎症反应是MIRI损伤的重要特征。心肌微血管内皮细胞(Cardiacmicrovascularendothelialcells,CMEC)是心脏微循环的重要组成部分，也是MIRI过程中最先波及且最先受损的部位，因此在MIRI损伤机制中发挥着重要作用。
　　Toll样受体4(TLR-4)为体内模式识别受体Toll样受体家族的主要成员，由于能够识别多种内源性和外源性配体，不仅可介导感染性炎症反应，在非感染性炎症反应中也发挥着重要作用。近年来TLR-4在MIRI中的作用也受到越来越多的关注。最新的研究表明：TLR-4基因缺陷小鼠(C3H/HeJ小鼠)与野生型小鼠(C3H/HeN小鼠)相比MIRI后的心肌梗死面积明显减少。进一步研究也证实，给予TLR-4特异性抑制剂eritoran阻断TLR-4信号通路能够对小鼠MIRI起到保护作用。因此，我们推测TLR-4信号通路可能参与了MIRI的炎症反应。
　　但是，目前的研究主要集中于TLR-4信号通路在心脏组织水平以及心肌细胞I/R损伤中的作用，而在CMECI/R损伤中的作用尚无报道。因此，本研究试图通过以下方法：1、体外分离培养CMEC；2、建立缺氧/复氧(H/R)模型，模拟I/R损伤；3、观察H/R损伤中TLR-4信号通路的变化；4、观察应用TLR-4中和性抗体阻断TLR-4信号通路是否对CMECI/R损伤具有保护作用，探讨TLR-4信号通路在CMECMIRI损伤中的作用。
　　实验方法
　　第一部分：CMEC的分离、培养及缺氧复氧模型的建立
　　无菌条件下取出大鼠心脏，利用化学消化法成功分离CMEC。用含15％胎牛血清(FCS)的DMEM培养液维持培养。取2-3代的CMEC缺氧6h后，分别复氧2h、12h及24h，采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测内皮细胞的增殖能力；Hochest染色检测细胞凋亡；硝酸还原法测定细胞培养液中一氧化氮(NO)分泌量；细胞划痕实验检测细胞迁移能力。
　　第二部分：TLR-4信号通路在CMEC缺氧复氧损伤中的变化
　　取体外培养2-3代的CMEC缺氧6h后，分别复氧2h、12h及24h。收集细胞培养液，并裂解细胞，获得CMEC蛋白。用Westernblot方法检测细胞TLR-4及NF-κB蛋白表达水平。用ELISA试剂盒检测培养液中炎性因子IL-6、TNF-α分泌水平。
　　第三部分：抑制TLR-4信号通路对CMEC缺氧复氧损伤的保护作用
　　取体外培养2-3代的CMEC，给予TLR-4中和性抗体MTS510（10ug/ml）37℃孵育2h后给予H/R处理。缺氧6h后复氧2h，再次用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测内皮细胞的增殖能力；用Hochest染色检测细胞凋亡；硝酸还原法测定细胞培养液中NO分泌量；利用细胞划痕实验检测细胞迁移能力。
　　实验结果
　　1.体外成功分离、培养大鼠CMEC。
　　2.与正常对照组相比，经过H/R损伤后，各组CMEC的增殖均明显受到抑制(P<0.05)，细胞凋亡率增加(P<0.05)；CMEC的NO分泌能力及迁移能力均显著下降(P<0.05)。
　　3.与正常对照组相比，TLR-4蛋白水平在复氧后2h及12h明显升高(P<0.05)，24h基本恢复正常；NF-κB蛋白水平在复氧2h、24h显著高于对照组(P<0.05)；而CMEC在复氧2h、12h及24h后分泌的IL-6和TNF-α水平均高于对照组(P<0.05)。
　　4.通过特异性中和性抗体阻断TLR-4信号通路，CMEC在缺氧6h复氧2h后，与单纯H/R处理组相比，增殖能力显著增加(P<0.05)，细胞凋亡率下降(P<0.05)；细胞迁移能力提高(P<0.05)；NO分泌能力以及eNOS表达水平显著增加(P<0.05)。
　　结论
　　1.H/R损伤可以导致CMEC增殖能力下降，凋亡增加，并导致细胞迁移能力、NO分泌下降等功能障碍。
　　2.在H/R早期，TLR-4/NF-κB信号通路激活，导致下游炎性因子IL-6、TNF-α分泌的增加，从而参与CMEC的炎症反应。
　　3.通过特异性中和抗体抑制TLR-4/NF-κB信号通路，可以减少H/R诱导的CMEC凋亡及功能障碍，对CMEC的H/R损伤具有保护作用。

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缩略语表

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前言

文献回顾

一、缺血再灌注损伤

二、内皮细胞与缺血再灌注损伤

三、Toll 样受体

正文

实验一：CMEC 的培养及缺氧复氧模型的建立

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二：TLR-4 信号通路在 CMEC 缺氧复氧损伤中的变化

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验三：阻断 TLR-4 信号通路对 CMEC缺氧复氧损伤的保护作用

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

附图

个人简历和研究成果

致谢