Toll样受体4信号通路在体外循环炎症反应中作用的实验研究

摘要

体外循环(CPB)期间，机体至少面临三方面打击：1.缺血再灌注损伤；2.人工循环管道等诱发的全身补体系统的激活；3.内毒素入血。这些可导致全身炎症反应综合症(systemicinflammatoryresponsesyndrome，SIRS)。而目前尚未发现治疗SIRS的有效策略。Toll样受体4(Toll-likereceptors4，TLR4)被认为是内毒素(LPS)跨膜信号转导的关键受体；缺血再灌注时机体释放的HSP70可能亦通过TLR4传导信号入细胞。本实验目的在于：1.研究在炎症信号触发的源头——细胞膜受体水平阻断CPB导致的炎症反应的可行性；2.评价人外周血单核细胞TLR4的变化在CPB后炎症反应中的作用，寻找指导临床治疗炎症反应的特征性客观指标。 第一部分:TLR4介导的LPS信号通路的转导研究 实验一:TLR4介导LPS经NF-κB途径的信号转导 目的：探讨LPS激活单核细胞NF-κB的信号途径。 方法：取单核细胞，加入终浓度10ng/ml的LPS刺激前，分别加入同体积的1640培养基、TLR4阻断剂(终浓度分别为5μg/mL，20μg/mL，30μg/mL)孵育30min，120min后中止反应，检测NF-κB的核移位变化；6h后收集上清液，ELISA法测TNF-a及IL-6浓度。 结果：LPS刺激加1640培养基、TLR4阻断剂(终浓度分别为5μg/mL，20μg/mL，30μg/mL)后核阳性细胞百分率分别为：61.19±13.10，40.89±7.93，29.33±4.51，28.97±8.14；不加LPS组，LPS刺激加1640培养基、TLR4阻断剂(终浓度分别为5μg/mL，20μg/mL，30μg/mL)组的TNF-α(pg/ml)的结果分别是：64.83，701.34，329.55，258.53，175.48；IL-6：57.08，2405.71，924.09，411.54，323.43，差异有显著性(P＜0.05或P＜0.01)。 结论：TLR4介导LPS经单核细胞NF-κB途径的信号转导。 实验二:TLR4介导LPS经ERK1/2途径的转导目的：探讨LPS激活单核细胞ERK的信号途径。方法：取单核细胞，加入终浓度10ng/ml的LPS刺激前，分别加入同体积的1640培养基、TLR4阻断剂(终浓度分别为5μg/mL，20μg/mL，30μg/mL)孵育30min，20min后中止反应，WesternBlot检测ERK1/2磷酸化变化。结果：TLR4阻断剂能显著抑制REK1/2的磷酸化。结论：TLR4介导LPS经单核细胞ERK1/2途径的信号转导。 第二部分:TLR4受体的特异性配体研究 目的：寻找TLR4受体新的配体，探讨HSP70与TLR4受体的相互关系。 方法：收集人单核细胞体外培养，加入终浓度5.0μg/mL的HSP70，分别在加入后0min，30min，60min，120min中止刺激，行细胞免疫组化检测NF-κB核移位变化；加入不同浓度的TLR4阻断剂(终浓度分别为5μg/mL，20μg/mL，30μg/mL)孵育30min后，HSP70刺激，120min后检测NF-κB的核移位变化。用流式细胞术检测HSP70刺激不同时间后单核细胞膜TLR4受体的变化。同时检测加用不同浓度的TLR4受体阻断剂后上清液TNF-a浓度，用ELISA法检测。 结果：HSP70可激活单核细胞NF-κB发生核移位，TLR4受体阻断剂可阻断HSP70的这一效应。HSP70的刺激可引起单核细胞膜TLR4受体数目显著下调。HSP70刺激单核细胞引起上清液TNF-a水平增加，加入TLR4受体阻断剂可显著降低TNF-a水平。 结论：HSP70可通过细胞膜TLR4受体传导信号，是TLR4的内源性配体。 第三部分:TLR4阻断剂对CPB血浆导致NF-κB及ERK1/2激活的影响 目的：验证阻断LTR4受体是否可以显著降低CPB血浆导致的NF-κB及ERK1/2的激活，从而减轻炎症反应。 方法：24孔培养板中加入单核细胞(2×105/孔，400μl)，分别加入TLR4阻断剂(终浓度分别为5μg/mL，20μg/mL，30μg/mL)孵育30min后，加入等量(400μl)上述血浆，120min后中止反应，检测NF-κB的核移位变化。于6孔培养板中加入单核细胞(2×106/孔，2ml)，分别加入TLR4阻断剂孵育30min，加入等量(2ml)上述血浆，20min后中止反应，WesternBlot检测ERK1/2变化。 结果：NF-κB的核移位及ERK1/2的磷酸化没有显著变化，P＞0.05。 结论：TLR4受体阻断剂并不能显著抑制CPB血浆导致的NF-κB及ERK1/2的激活。 第四部分:体外循环术后患者外周血单个核细胞TLR4变化及其意义 目的：探讨CPB后单核细胞TLR4的变化规律及意义，为SIRS的治疗寻求新的途径及评判标准。 方法：选取低温CPB心脏直视术病人24例。分别于T1(麻醉诱导前)、T2(术后30min)、T3(术后6h)、T4(术后24h)、T5(术后48h)5个时点抽取外周血2ml，分离单个核细胞(PBMC)，PE-抗人-TLR4单抗及FITC-抗人-CD14单抗标记，流式细胞术(FCM)分析单核细胞膜上TLR4、CD14的表达变化，同时用RT-PCR检测TLR4、CD14mRNA的表达变化；ELISA法检测血清中IL-6、TNF-a的浓度变化。 结果：与术前比较，CPB术后30min单核细胞CD14，TLR4的表达均下调。术后6h，两者表达上调。术后24h，CD14的表达恢复正常，TLR4继续上调，于术后48h达高峰。TLR4、CD14mRNA表达在CPB后持续增高。术后IL-6、TNF-a的浓度持续增高，于术后6h达到高峰。 结论：单核细胞TLR4介导CPB术后的炎症反应，其表达数量与机体免疫状态有关。

目录

缩写词表

前言

第一部分TLR4介导的LPS信号通路的转导研究

实验一、TLR4介导LPS经单核细胞LNF-κB途径的信号转导

材料与方法

结果

讨论

参考文献

实验二、TLR4介导LPS经ERK1/2途径的转导

一、材料与方法

二、结果

讨论

参考文献

第二部分TLR4受体的特异性配体研究HSP70可能是TLR4的内源性配体

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第三部分TLR4阻断剂对CPB后血浆诱发的炎症信号导效果的研究

一、材料和方法

二、结果

讨论

参考文献

第四部分体外循环术后患者外周血单个核细胞TLR4变化及其意义

材料和方法

结果

讨论

参考文献

小结

综述一:Toll受体介导的天然免疫信号传递系统

综述二：细胞信号转导

致谢