心钠素在原代培养大鼠耳蜗螺旋神经元细胞中的表达

摘要

目的：观察心钠素（atrial natriuretic peptide，ANP）在原代培养大鼠耳蜗螺旋神经元细胞（spiral ganglion neurons，SGN）中是否表达，并探讨其意义。
　　方法：1.对3～5日的新生SD大鼠耳蜗SGN进行原代培养以及纯化，倒置显微镜下进行细胞形态学观察；应用免疫细胞化学方法（免疫酶标以及免疫荧光法）检测原代培养SGN中神经元特异性核蛋白（neuron-specific nuclear protein，NeuN）表达情况，进行培养细胞的神经源性鉴定。
　　2.应用免疫细胞化学方法检测原代培养的SGN中ANP的表达情况，运用逆转录-聚合酶链式反应（reverse-transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）方法检测原代培养的SGN中是否存在编码ANP的mRNA。
　　结果：1.SGN的原代培养：细胞贴壁并生长24h后，多数SGN呈双极神经元特征形态，胞体两极伸出突起，可达胞体的2～5倍，并附着在成纤维细胞形成的单层细胞层表面生长；有的呈三极神经元形态，神经突向三个方向伸展。48～72h后，可见细胞突起交织成网状的细胞群，个别细胞突起可达胞体的7～8倍。还可见扁平多角形大胞体的成纤维细胞，以及长梭形双极的雪旺细胞（schwann cells）等非神经细胞。
　　2.SGN的免疫细胞化学：可见NeuN在SGN胞体和突起中具有阳性表达，而扁平多角形的成纤维细胞与长梭状雪旺细胞NeuN染色阴性；SGN的胞质中含有大量棕黄色ANP免疫反应阳性物质，为分散或成团的颗粒。免疫荧光染色显示原代培养SGN中NeuN、ANP、Hoechst荧光信号的共表达：红色荧光显示NeuN在椭圆形胞体和神经突起着色；绿色荧光显示ANP主要在细胞胞体和突起中着色，在近胞核周围的胞质中分布尤为密集；蓝色荧光为Hoechst衬染胞核。
　　3.ANP-mRNA在原代培养SGN细胞中的表达：培养5日SGN提取的RNA用RT-PCR方法扩增出编码ANP的单一条带，用凝胶成像及定量扫描仪测得片段大小为269bp，为目的基因片段。
　　结论：原代培养的SGNNeuN阳性表达，为神经组织来源，而且具有表达与合成ANP的能力，提示ANP可作为一种内源性激素，局部调节并维持内耳微环境稳态平衡；并且可能作为内耳SGN神经调节的一种递质或调质，参与其生理活动和突触传递功能的调节。本实验为进一步研究ANP对SGN神经调节作用的机制奠定了形态学基础。

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文献回顾

一．耳蜗螺旋神经元细胞的形态学和生理学特征：

二．心钠素及利钠肽受体的分布及功能调节机制

正文

第一部分大鼠耳蜗螺旋神经元细胞的原代培养及鉴定

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分心钠素在原代培养大鼠耳蜗螺旋神经元细胞中的表达

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢