Basigin选择性剪接体的鉴定及其在肝癌增殖和侵袭中的功能

摘要

真核生物能从有限的基因中转录翻译出大量mRNA和蛋白异构体，其主要机制就是mRNA前体的选择性剪接。选择性剪接是一种普遍的现象，35％～60％的人类基因均受选择性剪接的调控。选择性剪接不但可以通过改变蛋白编码序列来影响蛋白的结构和功能，还可以通过引入未成熟终止密码子激活NMD机制来调节mRNA水平。选择性启动子是真核基因多样性的另一重要机制，使mRNA具有不同的转录起始位点和选择性第一外显子，从而影响mRNA的转录、翻译并改变蛋白质氨基端结构。选择性剪接合并选择性启动子，既能调控蛋白异构体的结合活性、细胞定位、酶活性、蛋白稳定性，还可以调节基因表达的组织特异性和表达水平，有着重要的生物学意义。选择性剪接异常与多种疾病特别是肿瘤密切相关，通过调节剪接调控因子、癌基因的激活、抑癌基因的失活、细胞周期和细胞凋亡等过程，影响肿瘤细胞的增殖、运动、侵袭和耐药。
　　肿瘤间质是肿瘤细胞赖以生存的基础。基质金属蛋白酶（MMPs）是最重要的肿瘤-间质相互作用介导分子之一，能降解细胞外基质，促进肿瘤细胞侵袭。目前发现MMPs的表达主要受到basigin调控。Basigin又名EMMPRIN、OK血型抗原、CD147。我们实验室对此分子进行了长期的研究，并将其命名为HAb18G/CD147。Basigin是一种高度糖基化的单次跨膜糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族粘附分子成员。Basigin由位于染色体19p13.3上的BSG基因编码，其表达受Sp1、AP-2等转录因子调控。Basigin具有多种生物学功能，参与组织修复、生殖发育和能量代谢等过程。Basigin在肿瘤中表达上调，能通过诱导MMPs表达、降解ECM，促进肿瘤侵袭转移。Basigin目前已被作为一种新的肿瘤标志物，是一个理想的肿瘤治疗靶点。
　　Basigin的转录也同样受选择性剪接的调控，目前已发现有basigin-1、basigin-2、basigin-3和basigin-4四种剪接变异体，分别编码相应的蛋白异构体。其中basigin-2是最主要的剪接形式，其本质就是目前研究比较清楚的basigin分子，编码basigin/CD147/EMMPRIN蛋白。而对另外3种变异体的基因结构和功能研究较少。Basigin-1是一种视网膜特异性的具有3个Ig结构域的异构体，可能与感光细胞能量代谢有关。关于basigin-3和basigin-4的报道更少，对其表达和功能目前尚不明确。因此研究basigin的选择性剪接变异体及其蛋白异构体的特性、剪接机制、转录调控、表达分布、区别与basigin-2的独特功能，将有助于我们更系统的认识basigin家族的生物学功能及其在肿瘤侵袭和转移中的作用，对于深入理解肿瘤转移的分子机制和发现新的肿瘤治疗靶点均有着重要的意义。
　　本研究旨在全面系统的研究basigin各种选择性剪接变异体的剪接模式、表达调控、组织分布、蛋白结构、细胞定位，并参照basigin-2研究其他蛋白异构体在肝细胞肝癌中功能及其可能的分子机制。研究分为四个部分：
　　第一部分：Basigin选择性剪接变异体的表达、剪接模式和组织分布。我们首先使用变异体特异性PCR检测了basigin变异体在10种常见组织来源的肿瘤及正常细胞系cDNA中的表达，结果只有basigin-2、basigin-3和basigin-4能被扩增出来。接着我们使用RACE法克隆了basigin-3和basigin-4的cDNA全长序列，发现其两者有相同的转录起始位点，位于basigin-2的转录起始位点上游1227nt。采用荧光素酶报告系统，我们在basigin-3/4上游-656～-473区域内鉴定到一个选择性启动子，并受到Sp1等转录因子的调控。由此我们可以得出结论，BSG基因的转录同时受到选择性启动子和选择性剪接的双重调控，由10个外显子拼接出4种转录本。最后我们使用Taqman定量PCR检测了basigin转录本的组织分布，发现它们广泛表达于人体各组织，在部分组织中表达较高，同时还发现在肝癌组织中basigin-2和basigin-3的表达显著上调。
　　第二部分：Basigin蛋白异构体的表达。我们首先构建了GFP融合的basigin异构体稳定表达的肝癌细胞系，通过使用GFP抗体以及basigin异构体特异性抗体，我们确定basigin变异体mRNA可以翻译出相应的蛋白，这些蛋白存在糖基化修饰，并能定位到细胞膜上。同时我们使用RNA干涉等方法验证了细胞内源性basigin-3的表达。因此，在蛋白水平上能发挥功能的可能主要是basigin-2和basigin-3。而basigin-1具有视网膜特异性，basigin-4表达水平过低，因此在培养细胞中均难以检测到这两种异构体。
　　第三部分：Basigin蛋白异构体的体外、体内生物学功能。Basigin-2的功能目前比较清楚，在这一部分我们主要以basigin-2为参照，研究了basigin-3在肝癌增殖和侵袭中的功能。我们在体外进行了MTT增殖实验、划痕实验、明胶酶谱、Transwell侵袭实验，结果均表明basigin-3具有与basigin-2相反的功能，能够抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭。为进一步验证basigin-3的功能，我们又进行了动物体内实验，发现在裸鼠原位肝癌模型中，basigin-3同样能够在体内抑制肝癌的增殖和侵袭。这些结果均提示，basigin-3与已知的basigin-2的功能相反，可能是baisigin-2的内源性抑制剂。
　　第四部分：Basigin蛋白异构体间的相互作用。在这一部分我们主要探索了basigin-3发挥抑制功能的分子机制。Basigin-2的寡聚化是其发挥功能的重要因素，而basigin-3本质上是basigin-2的N端截短，具有高度同源性，两者之间也可能存在相互作用。为验证这一推测，我们首先进行了双分子荧光互补实验，结果发现basigin-3和basigin-2确实存在相互作用。然后我们又进行了NMR分析，结果发现basigin-3和basigin-2的相互作用界面位于近膜端的IgI结构域，通过该区域部分残基的相互作用，两者可以发生聚合。Basigin-3和basigin-2发生异源二聚，可能是其发挥抑制功能的分子基础。Basigin-3缺少具有诱导MMPs分泌的IgC2结构域，可能具有显性失活（dominantnegative）效应，与basigin-2结合后，抑制了basigin-2的诱导MMPs的功能，从而使抑制了肝癌的增殖和侵袭。
　　综上所述，本研究全面的阐明了BSG基因的选择性剪接及其蛋白异构体的功能。BSG基因具有10个外显子，在两个启动子的转录下，经外显子跨越/保留机制，产生出4中basigin剪接变异体。除了视网膜特异性的basigin-1外，其他3种广泛表达于人体各种组织中，且在肝癌中表达上调。Basigin剪接变异体均能翻译出相应的蛋白异构体，但只有广泛表达的basigin-2和basigin-3是主要的功能蛋白。与basigin-2促肿瘤增殖、侵袭的功能相反，basigin-3在体外和体内均能够抑制肝癌的增殖和侵袭。这种抑制作用可能是由于basigin-3和basigin-2发生异源二聚，发挥显性失活效应，阻断basigin-2诱导MMPs的产生。Basigin-3可能是basigin-2的内源性抑制剂，参与basigin-2功能的调节，应用basigin-3抑制肿瘤的增殖和侵袭可以作为肿瘤治疗的一种新策略。

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文献回顾

1 选择性剪接是真核基因表达多样性的主要机制

2 Basigin 是一种在生理和病理状态下发挥重要功能的膜蛋白

3 Basigin 基因的选择性剪接及其蛋白异构体

第一部分 Basigin 选择性剪接变异体的表达、剪接模式和组织分布

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分 Basigin 蛋白异构体的表达

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第三部分 Basigin 蛋白异构体的体外、体内生物学功能

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第四部分 Basigin 蛋白异构体间的相互作用

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢