内皮细胞紧密连接在电磁脉冲致血脑屏障开放中的作用及其机制研究

摘要

电磁脉冲(ElectromagneticPulse,EMP)是一种前沿极快、频谱较宽的短高压脉冲，可由核爆炸以及高压气体开关、特斯拉(Telsa)变压器等强电场仪器设备产生。由于EMP的特殊物理特性，它的生物学效应以及对处于这种电磁辐射环境中的工作人员或研究人员的健康危害已经引起人们的关注。我们前期研究发现，脑是EMP的敏感器官之一，一定条件的EMP辐照可导致大鼠血脑屏障(Blood-BrainBarrier,BBB)通透性增加，但其分子机制尚不清楚。由于紧密连接(TightJunction,TJ)在维持BBB结构和功能的完整性上发挥重要作用，本研究以TJ为切入点研究EMP致大鼠BBB开放中的作用及其分子机制。
　　本课题以成年雄性SD大鼠为研究对象，采用白蛋白免疫组织化学、蛋白杂交、硝酸镧示踪透射电子显微镜(TransmissionElectronicMicroscope,TEM)观察及伊文思蓝(EvensBlue,EB)示踪等方法观察一定强度EMP(200kV/m,200次脉冲及400次脉冲)全身辐照后大鼠BBB通透性的变化；采用蛋白杂交和免疫荧光等方法观察EMP辐照后大鼠大脑皮层脑组织和大脑皮层微血管中TJ相关蛋白(ZO-1,occludin)和细胞骨架蛋白(actin)的表达和分布变化。结果发现，与假辐照组相比，EMP辐照后0.5h大鼠大脑皮层BBB通透性开始增加，辐照后3h增加最为明显，辐照后6h开始恢复，辐照后12h恢复至假辐照组水平；透射电镜结果显示硝酸镧示踪物主要通过微血管内皮细胞之间的TJ进入到脑实质，提示TJ损伤是EMP辐照后大鼠BBB通透性改变的主要原因。此外，我们还发现，TJ蛋白ZO-1的蛋白水平在辐照后0.5h开始下降，3h降至最低，6h开始恢复，并且ZO-1在脑微血管内皮细胞上的分布也发生了相应改变，由原来的连续性分布变为串珠状分布。EMP辐照后ZO-1蛋白水平和分布的变化与BBB通透性的改变在时间上是一致的。TJ蛋白occludin和细胞骨架蛋白actin的蛋白水平和分布在辐照后无明显变化。以上结果表明EMP辐照可以引起大鼠BBB通透性的可逆性改变，TJ蛋白ZO-1可能参与了EMP致BBB开放的作用机制。
　　据文献报道，蛋白激酶C(Protein KinaseC,PKC)与BBB的通透性及与病理状态下BBBTJ蛋白的分布改变密切相关，为了探讨EMP致BBBTJ损伤和通透性增加的信号转导机制，我们采用酶联免疫吸附(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA)和蛋白杂交的方法检测了EMP辐照后大鼠大脑皮层脑组织和大脑皮层微血管中总PKC及其相关亚型(PKC-α和PKC-βⅡ)的蛋白水平。结果发现，与假辐照组相比，总PKC(PKC-α、PKC-βⅠ和PKC-βⅡ)和PKC亚型PKC-βⅡ蛋白水平在辐照后0.5h和1h升高，辐照后6-12h恢复至假辐照组水平，PKC-α蛋白水平在辐照后各时间点无明显改变。由于酶蛋白水平的变化可以间接反映酶的活性，该结果提示EMP辐照可以增加PKC及其亚型PKC-βⅡ的活性。
　　我们采用PKC的特异性抑制剂(H7)预处理动物，观察EMP辐照后BBB通透性的变化。结果发现，与EMP单纯辐照组相比，H7预处理组大鼠EMP辐照后BBB通透性明显降低。由于EMP辐照后可以引起BBB通透性增加及PKC活性增加，而抑制PKC后EMP辐照引起的BBB通透性增加得到减轻，因此可以证明PKC信号通路参与了EMP致大鼠BBB通透性增加的作用机制。
　　研究还发现PKC的特异性抑制剂(H7)预处理动物后部分阻止了EMP辐照导致的TJ蛋白ZO-1在微血管内皮细胞上的定位改变，提示PKC信号通路参与了EMP致TJ蛋白ZO-1的移位。
　　上述研究结果表明：TJ损伤在EMP致BBB通透性改变中发挥了重要作用；TJ蛋白ZO-1蛋白水平和蛋白分布的改变参与了EMP辐照后TJ损伤的作用机制；PKC信号通路参与了EMP致BBB通透性的改变和TJ蛋白ZO-1的移位。

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前 言

文献回顾

1 电磁辐射的性质及其生物学效应

2 血脑屏障的解剖学特征

3 BBB TJ

4. BBB 分子转运系统

5. 电磁辐射对 BBB 的影响

正 文

第一部分 EMP 对大鼠 BBB 通透性及 TJ 蛋白表达和分布的影响

1 前言

2 材料

3 方法

4 结果

5 讨论

第二部分 蛋白激酶 C 在 EMP 致 BBB 开放中的作用

1 前言

2 材料

3 方法

4 结果

5 讨论

小 结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢