促排卵药物对小鼠胚胎发育的影响及机制研究

摘要

研究背景：近30年来，辅助生殖技术（assistedreproductivetechnology,ART）在临床上的广泛使用使许多不育不孕夫妇有了自己的亲生孩子。但是目前辅助生育技术的成功率比较低,而且临床上ART后存在多胎妊娠率高引发高的母婴病死。如何提高成功率是各个辅助生殖中心所要解决的问题。为此各国生殖机构人员致力于研究一种更接近生理过程的单个囊胚移植,希望能有效提高妊娠率、降低多胎率。
　　目前胚胎评估的方法还主要是采用形态学评估，因为是人为操作评估，难免有主观因素介入。着床前胚胎遗传学诊断（preimplantationgeneticdiagnosis，PGD）则对胚胎有损伤。因而继续寻找无创的、客观量化的胚胎评估方法预测胚胎发育潜能成为目前生殖医学领域面临的问题之一。
　　超排卵（controlledovarianhyperstimulation,COH）是体外受精-胚胎移植（in-vitrofertilizationandembryotransfer,IVF-ET）技术中非常重要的方法,能募集卵母细胞，获得恰当数量的囊胚,为体外受精-胚胎移植技术广泛顺利开展提供了前提和保障。令人失望的是体外授精的受精率和卵裂率比较高，但是移植成功率很低，IVF胚胎多数发生移植失败，只有少数胚胎能发育到活产。而且超排卵导致子宫内膜容受性降低，妊娠率明显下降，胚胎质量降低。目前，超排卵影响胚胎质量和发育潜能的机制尚不明确，需要对其进行深入研究。阐明促排卵药物对胚胎发育的影响及其可能的机制，为寻找有效的生物学标记物进行准确预测胚胎发育潜能提供了理论基础。
　　研究目的：1采用ICR小鼠模型，通过体内体外实验体系，研究超排卵对囊胚发育、胚胎植入的影响。2通过基因芯片的方法，研究超排卵对小鼠囊胚基因表达谱的影响。3根据基因芯片的结果，选择编码分泌蛋白的差异基因，通过ELISA方法验证胚胎培养液中其分泌蛋白水平的变化，从而为开展早期胚胎的无创性临床诊断提供新思路。
　　研究方法：1通过超排卵受孕与自然受孕获取囊胚，采用体视显微镜进行囊胚形态学观察，测量囊胚直径并分级。2采用小鼠胚胎植入的体外模型，通过建立囊胚和子宫内膜共培养体系，在24h,48h和72h采用体视显微镜观察，比较自然受孕和超排受孕的囊胚在孵化、黏附和扩展方面的差异。3应用基因芯片杂交技术，研究超排卵对囊胚基因表达谱的影响。数据采用聚类分析、基因本体论（GeneOntology,GO）分析和京都基因与基因组百科全书（KyotoEncyclopediaOfGenesAndGenomes,KEGG)分析等方法进行处理。4通过实时定量聚合酶链反应（quantitativereal-timepolymerasechainreaction，qRTPCR）鉴定随机选取的14个差异表达基因。5在差异基因中寻找编码分泌蛋白的基因，采用酶联免疫吸附法（EnzymeLinkedImmunosorbentAssay,ELISA）法检测超排组和对照组胚胎培养液中IL-6蛋白的含量。
　　结果：1通过测量囊胚的直径，发现超排组囊胚的直径为145.3±76.9μm，与对照组（152.6±65.5μm）相比明显减小，统计结果表明差异非常显著（P<0.001）。此外，超排卵组囊胚细胞总数（68.9±6.9）亦明显少于对照组囊胚细胞总数（76.8±7.9）（P<0.01）。形态学观察进一步发现，超排组中三级囊胚数为2.1±0.20，对照组为0.9±0.1，差异具有非常显著性意义（P<0.01）。
　　2采用囊胚/子宫上皮细胞共培养系统观察24h,48h和72h，结果发现，与对照组相比，超排卵对胚泡孵化，黏附和扩展的影响不大，两者差异无统计学意义（p>0.05）。
　　3基因芯片杂交结果显示，和对照组相比，超排组囊胚一共有180个差异表达基因(≥1.5倍,p<0.01)，其中有108个基因表达下调，72基因表达上调。有5个编码分泌型蛋白的基因差异表达（IL-6、Efemp1、H2-K1、Ly96和Tgfbi）,其中IL-6，Efemp1和Tgfbi的功能是与胚胎发育相关的。
　　4qRT-PCR结果显示，随机挑选的14个差异基因表达变化与相应的微阵列实验结果相一致。
　　5体外培养胚胎从0.5dpc发育到3.5dpc时，超排组胚胎培养液中IL-6含量为3.973±1.392，显著低于正常组7.642±1.317，两者比较差异具有非常显著性意义（P<0.01）。并且培养液滴中IL-6含量越高，液滴中囊胚形成率越高。
　　结论：我们结果证实超排卵对胚胎质量和发育有影响。表现在囊胚直径减小、囊胚评估等级降低、但是胚胎植入能力没有发生改变。提示超排卵可能主要影响胚胎日后发育成胎儿部分的内细胞团，进而进一步影响胎儿的发育。
　　通过我们的研究首次发现超排卵引起小鼠囊胚180个基因表达改变，其中108个上调，72个下调，随机选择的14个基因进行qRT-PCR鉴定，结果与基因芯片结果相一致。
　　研究中我们首次从差异表达的基因中找出了5个能编码分泌蛋白的基因IL-6，H2-K1，ly96,Efemp1和Tgfbi，其中IL-6，Efemp1和Tgfbi这3个基因的功能是与胚胎发育相关的。通过ELISA方法我们验证了超排卵能够降低体外培养受精卵发育到囊胚时胚胎培养液中IL-6蛋白的水平，与超排卵降低IL-6基因表达相一致。同时发现培养液滴中IL-6蛋白含量越高，液滴中囊胚形成率越高。
　　总之，差异表达基因的发现，为促排卵药物对胚胎发育的影响提供了可能的机制。与胚胎发育有关的差异基因编码的分泌型蛋白IL-6的发现和进一步研究，为寻找有效的生物学标记物进行准确预测胚胎发育潜能提供了生物学研究资料。对指导临床实践，优化ART技术，建立无创性胚胎质量评估方法，从而提高临床的妊娠成功率、减少多胎妊娠率具有重要意义。

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缩略语表

中文摘要

英文摘要

前言

文献回顾

1 辅助生殖技术进展

2 IL-6 的研究进展

正文

实验一 促排卵对小鼠胚胎发育能力的影响

0 引言

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 超排卵对小鼠囊胚基因表达谱的影响

0 前言

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验三 促排卵对 IL-6 分泌的影响

0 引言

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢