单核细胞上调RPE细胞的SDF-1生成促进实验性脉络膜新生血管的血管发生

摘要

研究背景：脉络膜新生血管（CNV），为多发于黄斑部视网膜下的新生血管膜，易因出血、渗出及瘢痕形成而致盲。其形成包含血管生成（angiogenesis）和血管发生（vasculogenesis）两个形式。CNV是多种致盲性眼后节疾病的共同病理基础，尤其是年龄相关性黄斑变性（AMD），是目前西方国家中老年人群致盲的首要原因，且AMD患者中90％是因CNV致盲的。我国新生血管性AMD的发病率高于国际平均水平，而随着中国老龄化程度的加重，这一问题也将成为我国的一大社会问题。如何防治CNV是当前眼科学研究的重要课题。目前对于CNV和AMD的病因学和发病机理还不清楚。最近的研究提示AMD很可能是一种眼内免疫炎症反应驱动的疾病。以往研究显示巨噬细胞（Mφ）普遍存在于CNV中，可能发挥着重要的作用，但是具体是如何作用的尚不清楚。考虑到Mφ可能是免疫炎症反应的中心环节，研究Mφ在CNV发生发展中的作用和作用机制将有助于我们更好的理解CNV的发病机理，并可能为寻找新的治疗办法提供契机。
　　目的：探讨单核巨噬细胞（MC/Mφ）在实验性CNV中对血管发生的作用和作用机制
　　方法：清除MC/Mφ有效性检测：采用C57BL/6J小鼠尾静脉注射脂质体包裹的氯屈膦酸盐（clodronate-lip）清除MC/Mφ，脾脏组织免疫组化检测Mφ数量（F4/80标识）；药物毒性检测：制作DiO标记的脂质体，尾静脉注射小鼠体内后，免疫荧光染色检测视网膜色素上皮（RPE）细胞、内皮细胞（EC）和Mφ与脂质体的位置关系。体外脂质体与RPE细胞和猴脉络膜-视网膜内皮（RF/6A）细胞共培养，MTT法检测细胞增殖活性改变，ELISA检测培养上清中血管内皮生长因子（VEGF）及基质细胞衍生因子α（SDF-1α）水平；清除MC/Mφ对CNV的影响：将年轻（6～8周）绿色荧光蛋白（GFP）转基因小鼠的骨髓细胞移植给经Co60照射的成年野生型C57BL/6J小鼠（6～8wk）建立嵌合体小鼠，532nm激光光凝诱发嵌合体小鼠CNV。实验组小鼠静脉注射clodronate-lip清除全身MC/Mφ，同时设注射空脂质体（PBS-lip）小鼠为空载体对照组以及注射PBS小鼠为正常对照组。脉络膜铺片观察激光后3d和2w时激光斑处表达GFP的细胞量和CNV面积，组织切片免疫荧光染色观察激光后3d激光斑局部血管内皮生长因子（VEGF）和基质细胞衍生因子-1（SDF-1）表达量以及2wk时CNV內GFP细胞分化为EC（CD31标识）和平滑肌细胞（SMC，α-SMA标识）的细胞量；另观察移植老年（>18月）GFP骨髓的年轻C57小鼠清除MC/Mφ后3d和2wk时GFP细胞量和CNV面积改变。原代分离人单核细胞（MC），接触共培养或采用Millicell小室非接触共培养人RPE细胞和MC，PCR和ELISA检测RPE细胞和培养上清表达SDF-1和VEGF的mRNA和蛋白水平变化。
　　结果：静脉注射clodronate-lip后可有效清除小鼠脾脏中的MC/Mφ；脂质体在激光斑处主要为Mφ吞噬，无明显RPE细胞和EC吞噬脂质体现象。MTT显示与脂质体共培养的RPE和RF/6A细胞增殖能力无改变，分泌VEGF和SDF-1α无降低；嵌合体小鼠嵌合率>90％，接受年轻骨髓移植的小鼠，MC/Mφ清除后激光后3d激光斑处表达GFP细胞面积和比例明显减少，2wk时CNV內GFP细胞和CNV面积明显减小。空载体对照组和正常对照组间无明显差别。进一步发现，较之空载体组，3d时VEGF和SDF-1表达显著下降，2wk时嵌入CNV内的GFP细胞明显减少，并且分化为EC和SMC细胞的GFP细胞明显减少。接受老年骨髓移植的年轻小鼠清除MC/Mφ后在激光后3d和2wk时GFP细胞数量和CNV面积也显著减小。新鲜分离的MC和RPE细胞共培养4h后可刺激RPE细胞SDF-1mRNA水平明显升高，RPE细胞基础状态下SDF-1α水平在检测线下，共培养4h和24h时上清中SDF-1α蛋白水平明显高于Millicell非接触共培养的MC和RPE细胞的培养上清液中SDF-1α水平；而细胞共培养没有上调VEGFmRNA和蛋白的表达水平。
　　结论：全身清除MC/Mφ可减轻小鼠CNV生成的严重程度，减少骨髓来源细胞参与CNV的发生，此过程中伴随激光后局部VEGF和SDF-1表达水平下降，可能是这一抑制现象的原因之一；MC可能主要通过与RPE接触后刺激RPE产生SDF-1而促进CNV中的血管发生，而CNV发展中VEGF的改变则可能是一种伴随或者下游表现。

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缩略语表

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前言

文献回顾

一、炎症与 AMD、CNV 的关系

二、单核巨噬细胞与新生血管

三 骨髓来源细胞参与CNV血管形成

正文

实验一 药物清除单核巨噬细胞有效性和毒性检测

1 主要材料、试剂和仪器

2 实验方法

3 结 果

4 讨论

实验二 单核巨噬细胞清除对小鼠 CNV 和血管发生的影响

1 主要材料、试剂和仪器

2 实验方法

3 结果

4 讨论

实验三 单核细胞和 RPE 细胞共培养对 VEGF 和 SDF-1α表达的影响

1 主要材料、试剂和仪器

2 实验方法

3 结 果

4 讨论

小结

参考文献

个 人 简 历

致谢

附图