单核细胞增殖剂、单核细胞增殖用培养基、单核细胞的制造方法、树突状细胞的制造方法、及树突状细胞疫苗的制造方法

摘要

本发明提供能高效且简便地使单核细胞增殖的手段。本发明提供了一种在从单核细胞到树突状细胞的分化处理前使用的单核细胞增殖剂，其含有Flt-3L、IL-3或IFN-γ中的一种以上。另外本发明还提供了在从单核细胞到树突状细胞的分化处理前使用的单核细胞增殖用培养基，其含有Flt-3L、IL-3或IFN-γ中的一种以上。本发明的单核细胞增殖用培养基也可含有GM-CSF。

说明书

技术领域

本发明涉及单核细胞增殖剂、单核细胞增殖用培养基、单核细胞 的制造方法、树突状细胞的制造方法、及树突状细胞疫苗的制造方法。

背景技术

近年来，在癌症的治疗中，关注于树突状细胞疫苗的使用。树突 状细胞疫苗是由向树突状细胞（来自于给予疫苗的对象（例如癌症患 者））中引入了（脉冲了）癌抗原的树突状细胞制备的，其被给予至 疫苗给予对象的体内。给予的树突状细胞将癌抗原提呈至T细胞，提 呈了抗原的T细胞（CTL）特异性攻击癌细胞，因此能在不损伤体内 正常细胞的情况下治疗癌症。

但是，制造树突状细胞疫苗所必需的树突状细胞无法从体内直接 分离。因此，从由给予疫苗的对象采集的血液中分离单核细胞，将该 单核细胞分化为树突状细胞，由此来获得树突状细胞。

作为以往已知的为制造树突状细胞疫苗而使用的单核细胞的采 集方法，已知有使用成分采血装置分离血液中的白细胞的方法（下文 中将该方法称为“血采集术（apheresis）”）。但是，血采集术不仅 装置运用花费高，而且还要求高技术来进行装置的操作。另外，使用 血采集术采集的是不仅含有单核细胞、还含有除单核细胞以外的成分 （白细胞、红细胞、血小板等）的混合物。因此，为除去红细胞、血 小板等除单核细胞以外的成分，血采集术之后一般还要进行单核细胞 的分离步骤。

树突状细胞疫苗的临床应用中，优选在一次给予中使用大约1× 10⁷个的细胞数。为了确保这样的细胞数，通常，隔开间隔从同一对 象进行8次左右血采集术。另外，因为血液中存在的单核细胞的比例 较低，为了获得能制造树突状细胞疫苗的充分的量的单核细胞而使用 血采集术时，必须要使得血液在血采集术装置内循环并充分采集白细 胞成分，这会对患者在体力上或时间上造成非常大的负担。因此，存 在下述情况：在血采集术中，患者状态突然变化时，血采集术中途中 断，因此不得不放弃树突状细胞疫苗疗法。另外，在通过血采集术采 集单核细胞的成分的情况下，虽然通常能制作大约5～8次分量的树 突状细胞疫苗，但得到的树突状细胞疫苗的实际量根据患者的血液状 态等而变动。

另外，从胳膊等采集末梢血等以往的采血方法中，虽然患者负担 较轻，但存在下述缺点：即使根据以往的方法使得到的单核细胞直接 分化为树突状细胞，也无法获得足量的细胞数。因此，为了由从末梢 血的采血得到的单核细胞制造细胞数充足的树突状细胞疫苗，在该过 程中使单核细胞增殖是一个课题，克服其的技术是人们所期望的。另 外，这样的技术中，考虑到树突状细胞疫苗的给予间隔的情况下，关 于树突状细胞疫苗的制造时间，更期望能以2周左右进行制造。

因此，为了解决上述课题，考虑在体外使从血液分离的单核细胞 增殖。作为这样的方法，专利文献1中公开了在抑制单核细胞中特定 物质的表达的状态下培养单核细胞。但是，该方法需要重组体的制造 步骤以及长期的培养时间。

专利文献1：日本特表2010-515442号公报

发明内容

本发明的目的是提供能高效且简便地使单核细胞增殖的手段。

本发明的发明人等发现，参与造血干细胞的增殖等的特定细胞因 子能高效增殖单核细胞，由此完成了本发明。具体而言，本发明提供 了下述内容。

（1）一种在从单核细胞到树突状细胞的分化处理前使用的单核 细胞增殖剂，所述单核细胞增殖剂含有Flt-3L、IL-3或IFN-γ中的一 种以上。

（2）一种在从单核细胞到树突状细胞的分化处理前使用的单核 细胞增殖用培养基，所述培养基含有Flt-3L、IL-3或IFN-γ中的一种 以上。

（3）如（2）所述的单核细胞增殖用培养基，所述培养基含有 GM-CSF。

（4）一种单核细胞的制造方法，所述方法包括：

通过在（2）或（3）所述的单核细胞增殖用培养基中培养原料单 核细胞而使其增殖的增殖步骤。

（5）如（4）所述的单核细胞的制造方法，其中，使用含有单核 细胞以及除单核细胞以外的白细胞成分的混合物作为所述原料单核 细胞。

（6）如（4）或（5）所述的单核细胞的制造方法，包括：

在所述增殖步骤之前使体液中除单核细胞以外的成分的含有率 降低而得到所述原料单核细胞的降低步骤。

（7）如（6）所述的单核细胞的制造方法，其中，所述降低通过 使用磁性珠粒来进行，所述磁性珠粒针对所述原料单核细胞中的单核 细胞以及除单核细胞以外的白细胞成分、血浆、红细胞中的至少一者 的亲和性较之针对其他成分的亲和性更高。

（8）如（6）或（7）所述的单核细胞的制造方法，其中，从100 mL以下的末梢血获得所述原料单核细胞。

（9）如（6）～（8）中任一项所述的单核细胞的制造方法，其 中不包括冷冻贮藏所述单核细胞的冷冻贮藏步骤。

（10）一种树突状细胞的制造方法，所述方法包括：

通过（4）～（9）中任一项所述的单核细胞的制造方法制造单核 细胞的单核细胞制造步骤、和

使通过所述单核细胞制造步骤获得的单核细胞分化为树突状细 胞的分化步骤。

（11）如（10）所述的树突状细胞的制造方法，其中，在所述分 化步骤中，在含有Flt-3L、IL-3或IFN-γ中的一种以上的培养基中培 养所述单核细胞。

（12）如（10）或（11）所述的树突状细胞的制造方法，所述方 法包括脉冲所述树突状细胞的脉冲步骤。

（13）一种树突状细胞疫苗的制造方法，所述方法包括：

通过（10）～（12）中任一项所述的树突状细胞的制造方法制造 树突状细胞的树突状细胞制造步骤、和

将通过所述树突状细胞制造步骤获得的树突状细胞制备为树突 状细胞疫苗的制备步骤。

（14）如（13）所述的树突状细胞疫苗的制造方法，其中不包括 冷冻贮藏所述单核细胞及所述树突状细胞中的至少一者的冷冻贮藏 步骤。

（15）如（13）或（14）所述的树突状细胞疫苗的制造方法，其 中，所述原料单核细胞是由从给予所述树突状细胞疫苗的对象采集的 体液获得的。

通过本发明，能够提供能高效且简便地使单核细胞增殖的手段。

附图说明

图1为表示从末梢血分离单核细胞之前（A）以及分离之后（B） 时各细胞试样（3×10⁵个细胞）中含有的单核细胞数的图。

图2为表示在本发明的一种实施方式所涉及的单核细胞增殖剂存 在下培养3天、之后对单核细胞培养11天、使其分化为树突状细胞 时的细胞数的随时间变化的图。

图3为表示通过本发明的单核细胞增殖剂增殖的单核细胞分化为 成熟树突状细胞的图（A）和图（B）以及表示（A）和（B）中获得 的成熟树突状细胞具有抗原提呈能力的图（C）。

具体实施方式

下文对本发明的实施方式进行说明，但并非意图对本发明加以限 制。

<单核细胞增殖剂>

本发明的单核细胞增殖剂包含Flt-3L、IL-3或IFN-γ中的一种以 上，在从单核细胞到树突状细胞的分化处理前使用。需要说明的是， 本发明的单核细胞增殖剂的使用形式没有特别限定，一般认为能够以 添加至可培养单核细胞的培养基中、或作为培养基的成分预混合的形 式来使用。

“从单核细胞到树突状细胞的分化处理”是指：在适于使单核细 胞分化为树突状细胞的条件下、即、在规定量的特定细胞因子 （GM-CSF、IL-4及IL-6等）存在下培养单核细胞。已知即使在分化 处理的过程中单核细胞数也有一定程度的增加，但本发明的单核细胞 增殖剂并非用于该分化处理中，而是用于其之前的阶段。

关于上述各种细胞因子，使单核细胞分化为树突状细胞的量是 指：使在含有该量的细胞因子的培养基中在37℃、5%CO₂的条件下 培养了6天时总细胞数中的树突状细胞数为20%以上的量，具体的量 根据培养基的成分、培养条件而异。

通过本发明的单核细胞增殖剂，能在进行上述的分化处理之前将 单核细胞增殖至对于制造树突状细胞疫苗来说充足的量（例如10⁶～ 10⁷个细胞/mL以上），不必为树突状细胞疫苗而重复多次单核细胞 的培养步骤，因此是简便的。

虽然已知Flt-3L（Flt3-配体）、IL-3（白介素-3）、IFN-γ（干扰 素-γ）是参与造血干细胞的增殖等的细胞因子，但本发明的发明人等 经过研究，结果令人吃惊地发现，它们能高效地增殖单核细胞。

（Flt-3L）

适合用于使单核细胞增殖的Flt-3L的量没有特别限定，相对于可 培养单核细胞的培养基而言，可以是100～10000 IU/mL、优选1000～ 5000 IU/mL、最优选1000～3000 IU/mL。

（IL-3）

适合用于使单核细胞增殖的IL-3的量没有特别限定，相对于可培 养单核细胞的培养基而言，可以是100～10000IU/mL、优选100～5000 IU/mL、最优选500～3000IU/mL。

（IFN-γ）

适合用于使单核细胞增殖的IFN-γ的量没有特别限定，相对于可 培养单核细胞的培养基而言，可以是1～1000ng/mL、优选1～500 ng/mL、最优选1～50ng/mL。

本发明的单核细胞增殖剂可以单独使用Flt-3L、IL-3或IFN-γ中 的任一种，也可组合两种以上。如上文所述，因为Flt-3L、IL-3及IFN-γ 具有类似的功能，所以认为它们组合使用也不会妨碍相互的功能。在 组合它们中两种以上的情况下，各自的细胞因子配合量可以在上文所 述的范围内，也可以比其少。

通过流式细胞术分析所得细胞的细胞表面标志物，来确认通过本 发明的单核细胞增殖剂增殖的细胞是否是单核细胞。作为单核细胞的 细胞表面的标志物，可以举出CD14等。具有这样的标志物的细胞可 认为是单核细胞。

<单核细胞增殖用培养基>

本发明的单核细胞增殖用培养基含有Flt-3L、IL-3或IFN-γ中的 一种以上，在从单核细胞到树突状细胞的分化处理前使用。具体而言， 单核细胞增殖用培养基可进一步含有可用于培养单核细胞的营养成 分、pH调节剂等。作为含有上述成分的培养基没有特别限定，可举 出淋巴细胞用的无血清合成培养基、AIM-V、RPMI-1640等。需要说 明的是，本说明书中的“培养基”不仅包含液体化的制备完成的形态， 也包含制备前的成分混合物（通常为粉末形式）。

本发明的单核细胞增殖用培养基也可进一步含有参与单核细胞 分化的细胞因子（GM-CSF（粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 （Granulocyte Macrophage Colony-Stimulation Factor））。

单核细胞具有在GM-CSF存在下易于向巨噬细胞分化、在 GM-CSF及IL-4存在下易于向树突状细胞分化的倾向。但是，本发明 的发明人研究发现，利用含有GM-CSF的本发明的单核细胞增殖用培 养基，能显著促进单核细胞的增殖。GM-CSF自身具有单核细胞的增 殖效果虽然是以往已知的，但含有GM-CSF的本发明的单核细胞增殖 用培养基能在不使单核细胞分化的情况下显著促进单核细胞的增殖。 另外，本发明的单核细胞增殖用培养基中除了GM-CSF之外还可进一 步含有比使单核细胞分化为树突状细胞的量（例如500～2000 IU/mL） 少的IL-4。本发明的单核细胞增殖用培养基中含有的GM-CSF，例如 可为500～2000 IU/mL的范围。

本发明的单核细胞增殖用培养基中可含有细胞培养中通常使用 的试剂。作为这样的试剂，可举出抗生素（庆大霉素、卡那霉素等）、 清蛋白、血清（胎牛血清等）等。另外，本发明的单核细胞增殖用培 养基中可含有来自生物体（例如人、猪、牛、马、山羊、绵羊、兔、 袋鼠、猴等哺乳类动物）的自体血浆（即，意味着想要增殖的单核细 胞和自体血浆是从相同生物体获得的）。另外，为了促进向树突状细 胞的分化诱导，本发明的单核细胞增殖用培养基中可含有氯化 Picibanil、前列腺素E2（PGE2）等。

<单核细胞的制造方法>

本发明的单核细胞的制造方法包括通过在本发明的单核细胞增 殖用培养基中培养原料单核细胞使其增殖的增殖步骤。

（增殖步骤）

作为本发明的增殖步骤中使用的条件，没有特别限定，从在较多 单核细胞分化开始前使单核细胞增殖的观点来看，可以在30～40℃、 2～8%CO₂的条件下进行培养。培养时间可根据所需要的单核细胞的 量适当地调整，可以为3～20日、3～18日、3～14日、3～10日。培 养中，可根据以往公知的方法适当地进行培养基更换。

根据本发明的单核细胞的制造方法，例如可以以14天这样的短 的培养时间使原料单核细胞中的单核细胞增殖至可临床使用的水平 （例如，10⁶～10⁷个细胞/mL以上）。所谓可临床使用的水平是指： 在将树突状细胞（使已增殖的单核细胞分化而成的）制备为树突状细 胞疫苗的情况下，获得的树突状细胞疫苗可直接作为非冷冻处理疫苗 使用的水平。

本发明的单核细胞的制造方法中，在于本发明的单核细胞增殖用 培养基中培养单核细胞这样的、对单核细胞的负荷较少的条件下使单 核细胞增殖。因此，能够期待通过本发明的单核细胞的制造方法以高 的活细胞率（例如超过90%）获得单核细胞。

（原料单核细胞）

本发明的原料单核细胞为含有单核细胞的试样。原料单核细胞可 以仅由单核细胞构成，另外，因为通过本发明的单核细胞的制造方法 能选择性地高效增殖单核细胞，所以原料单核细胞也可以为含有单核 细胞和除单核细胞以外的白细胞成分（例如淋巴细胞、NK细胞、NKT 细胞）的混合物。该混合物可进一步含有血浆、红细胞。作为混合物， 可以是从血液等体液的试样经密度梯度离心分离等获得的、主要含有 单核细胞及淋巴细胞的单核细胞级分。

（降低步骤）

优选在上述增殖步骤之前进行降低步骤，即，降低体液中的单核 细胞以外的成分的含有率来获得上述原料单核细胞。降低例如可通过 使用磁性珠粒的方法、密度梯度离心法、通过仅将体液中的成分中的 单核细胞粘附于培养皿而分离单核细胞的方法、上述方法的组合等来 进行。

从能简便且高效地回收单核细胞、对单核细胞的损伤小的方面来 说，优选使用磁性珠粒。该磁性珠粒对原料单核细胞中的单核细胞及 除单核细胞之外的白细胞成分、血浆、红细胞中的至少一种（优选全 部）具有比对其它物质更高的亲和性。所述磁性珠粒可以具有针对想 要分离的物质的抗体等结合在带有磁性的载体上的构造。另外，关于 对体液进行密度梯度离心得到的单核细胞级分，从单核细胞的收率进 一步提高的观点来看，优选通过磁性珠粒进行处理。

使用针对单核细胞具有相对高的亲和性的磁性珠粒时，能从体液 主要分离单核细胞（这被称为单核细胞的阳性选择）。通过以往公知 的方法从分离的单核细胞除去磁性珠粒，由此能够获得原料单核细 胞。虽然从准备的磁性珠粒的种类较少的观点来看这种方式是有利 的，但是必需要有从单核细胞除去磁性珠粒的步骤，对单核细胞的损 伤存在若干担忧。

使用对除单核细胞以外的白细胞成分、血浆、红细胞中的至少一 种具有相对高的亲和性的磁性珠粒时，可从体液除去除单核细胞以外 的成分（这被称为单核细胞的阴性选择）。其结果，能获得主要含有 单核细胞的原料单核细胞。虽然从准备的磁性珠粒的种类较多的观点 来看这种形式是不利的，但不需要从单核细胞除去磁性珠粒的步骤， 从能确实地获得优质单核细胞的方面考虑为优选。进行单核细胞的阴 性选择的试样也可以是对体液进行密度梯度离心获得的单核细胞级 分。这种情况下，使用针对淋巴细胞具有相对高的亲和性的磁性珠粒。

使用磁性珠粒的情况下，可使用磁性细胞分离装置。磁性细胞分 离装置通过在装置内设置血液等体液的试样以及磁性珠粒等试剂，基 于规定的程序从体液分离单核细胞。从能从体液迅速且高效地分离单 核细胞的观点来看，使用这样的装置是优选的。以高收率分离单核细 胞时，能显著提高由本发明的单核细胞增殖剂获得的单核细胞的增殖 效率。

作为适于本发明的磁性细胞分离装置，例如可举出“RoboSep（商 标）”（株式会社Veritas）等。

（体液）

作为用于获得原料单核细胞的试样，可举出血液、骨髓液这样的 体液。血液采集自生物体（例如人癌症患者），可举出末梢血、脐带 血等。其中从减轻被采集者的负担的观点来看，优选末梢血。作为体 液的采集方法没有特别限定，可采用使用注射器、蝴蝶针等从胳膊、 手腕、脚等部位进行采集的方法。本发明的单核细胞的制造方法中， 由于使用的体液的量少，所以与以往使用的血采集术等方法相比，采 集体液时对生物体的负担（费用、时间等）显著较低。

以往为了制造树突状细胞疫苗，从生物体采集例如300～400mL 的大量血液。但是，根据本发明的单核细胞的制造方法，使用的体液 的量也可为100mL以下、90mL以下、80mL以下、70mL以下、60 mL以下、50mL以下、40mL以下、35mL以下、30mL以下、25mL 以下、20mL以下、15mL以下、10mL以下、5mL以下、1mL以 下、0.5mL以下的较少的量。体液量的下限没有特别限定，例如可以 为0.1mL以上。

根据本发明的单核细胞的制造方法获得的单核细胞可以直接经 过分化步骤分化为树突状细胞，也可采用以往公知的方法冷冻贮藏。 冷冻贮藏的单核细胞可以在解冻之后用于单核细胞的分化步骤。但 是，从防止能分化的单核细胞的损失的观点来看，优选不冷冻贮藏单 核细胞。本发明中，不需要为了获得供给于分化步骤的单核细胞而进 行多次单核细胞培养，因此可以将单核细胞供给于单核细胞的分化步 骤而不冷冻贮藏。

<树突状细胞的制造方法>

本发明的树突状细胞的制造方法包括：根据本发明的单核细胞的 制造方法制造单核细胞的单核细胞制造步骤、和使根据上述单核细胞 制造步骤获得的单核细胞分化为树突状细胞的分化步骤。

（分化步骤）

使单核细胞分化为树突状细胞的方法本身是以往公知的。即，通 过在含有例如IL-4等的分化用培养基中培养单核细胞，单核细胞分化 为未成熟的树突状细胞。通过在含有TNF-α等的培养基中培养所得的 未成熟树突状细胞，未成熟树突状细胞分化为成熟树突状细胞。本发 明中的树突状细胞包括未成熟树突状细胞及成熟树突状细胞双方。

在本发明的分化步骤中，也优选使用含有Flt-3L、IL-3或IFN-γ 中的一种以上的培养基。由此可在增殖单核细胞的同时使其向树突状 细胞分化，能获得更多数量的树突状细胞。但是，通过增殖步骤所得 的单核细胞的数量充足、或者所需要的树突状细胞的数量不多的情况 下，也可不使用含有上述成分的培养基。

（脉冲步骤）

通过向获得的未成熟树突状细胞或成熟树突状细胞引入（脉冲） 从癌细胞提取的物质（肽等）或癌特异性抗原、人工抗原等，能获得 可提呈所期望的抗原的树突状细胞。需要说明的是，脉冲步骤可在制 造树突状细胞的过程中进行，也可如下文所述在树突状细胞的制造后 的疫苗制备的过程中进行。

作为脉冲的方法，只要是能将期望的抗原引入树突状细胞中的方 法即可，没有特别限定，可举出将树突状细胞与期望的抗原一起培养 的方法等。一般而言，与成熟树突状细胞相比，未成熟树突状细胞更 容易引入抗原，因此优选对未成熟树突状细胞进行脉冲。

通过采用流式细胞术分析树突状细胞的细胞表面标志物，来确认 得到的细胞是否是树突状细胞。作为树突状细胞的细胞表面标志物， 可以举出CD83等。具有这样的标志物的细胞认为是树突状细胞。

通过采用流式细胞术分析树突状细胞的细胞表面标志物，来确认 根据本发明的树突状细胞的制造方法获得的树突状细胞是否具有抗 原提呈能力。作为具有抗原提呈能力的树突状细胞的细胞表面的标志 物，可以举出MHC Class I分子（HLA-A、B、C）及MHC Class II 分子（HLA-DR）等。认为具有这样的标志物的树突状细胞具有抗原 提呈能力。

<树突状细胞疫苗的制造方法>

本发明的树突状细胞疫苗的制造方法包括：根据本发明的树突状 细胞的制造方法制造树突状细胞的树突状细胞制造步骤、及将通过上 述树突状细胞制造步骤获得的树突状细胞制备为树突状疫苗的制备 步骤。

（制备步骤）

将树突状细胞制备为树突状细胞疫苗的方法没有特别限定，可以 举出：将树突状细胞与在通常的疫苗制剂中配方的药剂（生理盐水、 林格液等）混合。另外，使用未经过脉冲步骤的树突状细胞的情况下， 对树突状细胞进行脉冲步骤。

本发明的树突状细胞疫苗的制造方法也可不包括对单核细胞及 树突状细胞中的至少一者进行冷冻贮藏的冷冻贮藏步骤。本发明的树 突状细胞疫苗的制造方法中，能在短时间内获得能足以制造树突状细 胞疫苗的充分的量的单核细胞或树突状细胞，因此能即时制备单核细 胞或树突状细胞不需要贮存。因此，根据需要制造的单核细胞或树突 状细胞可以不冷冻保存而供给至树突状细胞疫苗的制造。由此，可以 避免冷冻可能造成的细胞损伤、树突状细胞的抗原提呈能力的降低。

获得的树突状细胞疫苗可通过皮内注射等以往已知的方法给予 生物体。

原料单核细胞优选为由从给予树突状细胞疫苗的对象中采集的 体液获得的。通过使用来自给予树突状细胞疫苗的对象的原料单核细 胞，能获得有害的副作用少的树突状细胞疫苗。但是，只要给予树突 状细胞疫苗产生的免疫反应被许可，则也可使用从并非给予对象的人 员中采集的体液。

实施例

下面基于实施例说明本发明，但本发明不限于下述实施例。

〈实施例1：单核细胞的分离〉

从3名癌症患者的胳膊采集25mL末梢血。将上述末梢血分别用 Ficoll溶液（GE Healthcare Japan株式会社）进行密度梯度离心，获得 单核细胞级分的细胞。将获得的单核细胞级分的细胞装到磁性细胞分 离装置（商品名：RoboSep，株式会社Veritas），按照设定为用于单 核细胞分离的程序，分离了CD14⁺单核细胞及CD16⁺单核细胞。

针对分离单核细胞之前的末梢血以及从末梢血分离出单核细胞 后的试样，按照下述条件测量各试样中的单核细胞数。

针对各试样中的3×10⁵个细胞，通过流式细胞术分析细胞表面的 标志物。需要说明的是，作为标志物使用单核细胞的标志物CD14。 其结果示于图1。如图1所示，将分离单核细胞前（A）和分离之后 （B）进行比较可知，通过分离步骤，相对于试样中细胞数的单核细 胞个数（分离前：534个；分离后：2938个）显著增加，获得了单核 细胞被浓缩的试样。

〈实施例2：单核细胞的增殖〉

按照下述条件，在含有本发明的单核细胞增殖剂（本实施例中使 用了Flt-3L）的单核细胞增殖用培养基中，培养按照上述方法分离的 来自癌患者的单核细胞（CD14⁺单核细胞及CD16⁺单核细胞）。

（单核细胞增殖用培养基的组成）

淋巴细胞用无血清合成培养基（X-VIVO 15、Takara Bio株式会 社）

Flt-3L（Cellgenix公司） 2000 IU/mL

GM-CSF（Miltenyi Biotec公司） 1000 IU/mL

庆大霉素 50 ng/mL

5%自体血浆（从各癌症患者获得的血浆）

向上述单核细胞增殖用培养基中添加经分离的单核细胞使其相 对于培养基为2×10⁵个细胞/mL，于37℃、5% CO₂的条件下培养3天。 培养第4天起用实施例3中的单核细胞分化用培养基（1）培养8天。 培养的第12天起用实施例3中的单核细胞分化用培养基（2）培养3 天。即，培养时间总计为14天。

将培养开始时刻、培养3天后、培养6天后、培养11天后及培 养14天后的各时间点的单核细胞回收，台盼蓝染色，用显微镜观察， 计算细胞数。该结果示于图2。如图2所示，在培养第3天的时间点 单核细胞增至2×10⁶个细胞/mL左右。在该时间点，可供给至分化步 骤。进而，在分化步骤中也在本发明的单核细胞增殖剂的存在下进行 培养，由此能期待获得10⁷个细胞/mL以上的树突状细胞。

〈实施例3：单核细胞的分化〉

按照下述条件培养上述获得的单核细胞

（单核细胞分化用培养基（1）的组成）

通过向单核细胞增殖用培养基中添加1000 IU IL-4（Miltenyi  Biotec公司），制备用于使得单核细胞向未成熟树突状细胞分化的培 养基。下文中将该培养基称为“单核细胞分化用培养基（1）”。

（单核细胞分化用培养基（2）的组成）

通过向单核细胞分化用培养基（1）中进一步添加下述成分，制 备用于使未成熟树突状细胞向成熟树突状细胞分化的培养基。下文中 将该培养基称为“单核细胞分化用培养基（2）”。

IL-1β（Miltenyi Biotec公司）10ng/mL

IL-6（Miltenyi Biotec公司）1000IU/mL

PGE-2（Cayman Chemical公司）1μg/mL

TNF-α（Miltenyi Biotec公司）20ng/mL

0.1KE氯化Picibanil（中外制药）

庆大霉素50ng/mL

5%自体血浆（从各癌症患者获得的血浆）

将增殖的单核细胞（即，在实施例2的条件下在第3天培养获得 的单核细胞）于单核细胞分化用培养基（1）中在与单核细胞的增殖 相同的条件下培养8天，使其分化为未成熟树突状细胞。在8天的培 养结束的时间点，添加抗原肽，进行脉冲。

将获得的未成熟树突状细胞于单核细胞分化用培养基（2）中在 与单核细胞的增殖相同的条件下培养3天，使其分化为成熟树突状细 胞。

针对获得的成熟树突状细胞，通过流式细胞术分析细胞表面的标 志物。需要说明的是，作为标志物，使用成熟树突状细胞的标志物 CD83和单核细胞的标志物CD14。其结果示于图3（A）。另外，使 用成熟树突状细胞的标志物CD83作为标志物，通过流式细胞术分析 获得的成熟树突状细胞的数量。其结果示于图3（B）。由图3（A） 及（B）所示可知，分化后的细胞中不存在表达CD14的细胞（即单 核细胞），但存在表达CD83的细胞（即成熟树突状细胞），因此单 核细胞分化为了成熟树突状细胞。

另外，使用MHC Class I分子（HLA-A、B、C）及MHC Class II 分子（HLA-DR）作为标志物，通过流式细胞术分析获得的成熟树突 状细胞的抗原提呈能力。其结果示于图3（C）。由图3（C）所示可 知，获得的成熟树突状细胞表达MHC Class I分子及MHC Class II分 子，具有抗原提呈能力。

〈实施例4：关于各种细胞因子对单核细胞增殖的影响的研究〉

按照下述条件研究本发明的单核细胞增殖剂（Flt-3L、IL-3或 IFN-γ）及各种细胞因子（SCF、IFN-α或IFN-β）对单核细胞的增殖 造成的影响。

将按照实施例1记载的方法分离的单核细胞添加至96孔板内， 使其在培养基中为1×10³个细胞/孔，于37℃、5%CO₂的条件下培养 6天。需要说明的是，该培养基的组成如下文所述。

（培养基组成）

淋巴细胞用无血清合成培养基（X-VIVO 15、Takara Bio株式会 社）

按照表1的矩阵组合的细胞因子（各细胞因子的使用量如下所示）

需要说明的是，表1中，所谓“增殖因子”是本发明的单核细胞 增殖剂（Flt-3L、IL-3或IFN-γ）及各细胞因子（SCF、IFN-α及IFN-β） 的合称。

在显微镜下目视观测培养完成后的细胞数，与“不添加增殖因子” 且“不添加GM-CSF及IL-4”的条件下的结果进行比较，判定各细胞 因子对单核细胞增殖的影响。其结果示于表1。需要说明的是，判定 基准如下所示。

±：无变化

+：略微促进单核细胞增殖

++：促进单核细胞增殖

+++：显著促进单核细胞增殖

[表1]

如表1所示，利用本发明的单核细胞增殖剂（Flt-3L、IL-3或 IFN-γ），促进了单核细胞的增殖。另外，在本发明的单核细胞增殖 剂基础上，通过进一步组合GM-CSF，单核细胞的增殖被显著促进。

〈实施例5：关于单核细胞的活细胞率的研究〉

按照下文所述的条件，对使通过本发明的单核细胞增殖剂增殖的 单核细胞分化而获得的树突状细胞的活细胞率进行研究。

从20名癌症患者的胳膊采集约25mL末梢血。与实施例1相同 地从获得的末梢血分离单核细胞。接着，与实施例2相同地使单核细 胞增殖，与实施例3相同地使获得的单核细胞分化为成熟树突状细胞。

针对获得的成熟树突状细胞，进行台盼蓝染色计算总细胞数（获 得的成熟树突状细胞的总数）和活细胞率。其结果示于表2。需要说 明的是，基于下式算出活细胞率。

活细胞率（%）=活细胞的总数（未染色细胞数）/总细胞数（染 色细胞数和未染色细胞数之和）×100

[表2]

  总细胞数（×10⁷） 活细胞率 患者1 1.05 97.2% 患者2 1.09 96.5% 患者3 1.10 97.0% 患者4 1.15 97.0% 患者5 1.03 97.0% 患者6 1.01 97.3% 患者7 1.03 98.1% 患者8 1.04 97.3% 患者9 1.23 97.5% 患者10 1.04 97.7% 患者11 1.06 97.9% 患者12 1.17 96.7% 患者13 1.10 98.7% 患者14 1.14 97.8% 患者15 1.07 97.1% 患者16 1.12 97.1% 患者17 1.03 97.9% 患者18 1.05 98.2% 患者19 1.11 96.7% 患者20 1.02 97.8%

如表2所示，通过本发明，能期待稳定获得1.0×10⁷以上的细胞 数和约97%以上的活细胞。