胃癌多药耐药逆转短肽GMBP42受体的初步筛选及其功能研究

摘要

近年来，尽管肿瘤治疗已有很大进步，不断研发新的抗肿瘤药物、出现新的治疗方案，但是治疗效果仍不尽如人意。多药耐药（MDR），是肿瘤化疗失败的主要原因[1]。针对胃癌多药耐药，目前仍缺乏理想的耐药程度判断标准和有效的耐药逆转剂或调节剂，是亟待解决的重要问题。以经典耐药分子p糖蛋白为靶点，虽已有四代逆转剂，通过基础和临床实验证实能够发挥逆转耐药的作用，但由于其毒副作用和不良的药物代谢动力学作用，尚未被应用于临床[2]。因此，探索新的胃癌耐药逆转方法和解决策略，研发新的耐药逆转剂，对胃癌成功治疗有着非常重大的意义。在药物研发方面，小分子短肽有众多优点，具有应用于临床的优势，是目前研究的热点领域[3]。前期研究中，我们课题组利用噬菌体随机十二肽库，通过体外生物淘选耐药细胞和亲本细胞，获得了能特异结合于胃癌耐药细胞的短肽GMBP42。体内药效学研究初步证实，GMBP42能够在裸鼠体内抑制耐药肿瘤生长，部分逆转肿瘤的耐药表型，提高肿瘤对化疗药物的敏感性。进一步鉴定耐药逆转短肽GMBP42的结合受体，深入研究其在耐药中的作用及分子机制，对于全面认识肿瘤耐药机理有重要意义，并为研发新型多药耐药逆转生物制剂奠定实验基础和提供理论支持。本课题将在这方面展开研究。
　　【目的】
　　1.鉴定GMBP42在耐药细胞中的结合，获得其受体的分布信息。
　　2.筛选GMBP42的结合受体，为探讨GMBP42的作用机制奠定基础。
　　3.明确GMBP42的耐药逆转作用，初步分析其作用机制。
　　【方法】
　　1.免疫细胞化学染色方法观察GMBP42在耐药细胞的结合，明确受体的亚细胞定位。流式细胞仪分析GMBP42的受体在耐药细胞的表达量。
　　2.免疫共沉淀纯化和富集GMBP42结合的受体蛋白，质谱分析初步筛选GMBP42结合受体。
　　3.MTT实验观察GMBP42对细胞生长的影响。
　　4.体外药物敏感实验检测GMBP42在细胞中对抗肿瘤药物IC50值的影响。
　　5.阿霉素蓄积和潴留实验观察GMBP42对药物在细胞内蓄积和潴留的影响。
　　6.细胞凋亡分析GMBP42对细胞凋亡的影响。
　　7.RT-PCR方法检测GMBP42对部分耐药相关膜分子表达水平的影响。
　　8.Western-blot方法检测GMBP42作用细胞后MDR1和凋亡相关分子（BCL-2,BAX）的表达情况。
　　【结果】
　　1.GMBP42与细胞的结合情况和结合受体的相关信息。1)免疫细胞化学结果说明GMBP42在耐药细胞SGC7901/VCR和SGC7901/ADR中呈阳性反应，胞膜和核周胞浆均可见明显的阳性颗粒（棕黄色或者棕褐色），在亲本SGC7901细胞中呈阴性反应。
　　2)流式细胞分析结果显示GMBP42结合的受体在耐药细胞SGC7901/VCR和SGC7901/ADR中表达量要明显多于亲本SGC7901细胞。
　　3)免疫共沉淀纯化富集GMBP42结合的蛋白，质谱分析初步筛选GMBP42结合受体。延伸因子1α（EEF1A，Elongation factor 1-alpha）在两个蛋白条带中均检测到，是我们所关注的受体候选分子。
　　2.GMBP42在逆转耐药中的作用和分子机制研究。
　　1)MTT实验结果证实GMBP42不影响耐药细胞的正常生长。
　　2)体外药物敏感实验证实GMBP42可以降低耐药细胞SGC7901/VCR和SGC7901/ADR阿霉素、5-氟尿嘧啶和丝裂霉素的IC50值，提高耐药细胞对这些药物的敏感性，而对顺铂的IC50值没有影响。
　　3)阿霉素蓄积和潴留实验结果显示，GMBP42作用耐药细胞后，阿霉素蓄积和潴留的荧光强度要明显强于对照组，说明GMBP42能增加阿霉素在细胞内蓄积和潴留。
　　4)FCM分析细胞的凋亡，加入GMBP42后的耐药细胞，与对照组相比，凋亡指数增加，说明GMBP42能够促进药物诱导细胞发生凋亡。
　　5)RT-PCR结果显示加入GMBP42的耐药细胞组，耐药相关膜分子MDR1((P-gp)在RNA水平上表达下降。
　　6)Western-blot结果显示GMBP42作用后的耐药细胞，从蛋白水平上耐药相关膜分子MDR1(P-gp)的表达量下降，凋亡抑制基因BCL-2的表达降低，凋亡促进基因BAX的表达升高。
　　【结论】
　　1.GMBP42与耐药细胞高亲和力结合，受体在耐药细胞的表达量要明显高于亲本细胞。对GMBP42结合受体的初步筛选，共得到了19个候选蛋白分子，其中延伸因子1α（EEF1A，Elongation factor 1-alpha）在两个蛋白条带中都出现，是最有可能的候选受体分子。
　　2.GMBP42对细胞的生长本身无影响，可增加细胞内药物的蓄积和潴留，降低部分化疗药物的IC50值，促进细胞的凋亡。此作用可能通过调节凋亡相关基因BCL-2/BAX、降低耐药相关膜分子MDR1的表达得以实现的，其相关分子机制仍需深入研究。

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缩略语表

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前言

文献回顾

一、胃癌与多药耐药

二、多药耐药逆转剂的研究进展

三、短肽药物的研究进展

四、本实验室在胃癌多药耐药及其逆转方面的研究

正文

第一部分：GMBP42 的受体在耐药细胞中的表达及初步筛选

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分：GMBP42 在逆转耐药中的作用和分子机制的初步研究

1 材料

2 方法

3 结果

4.讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢