氮氧自由基R-1对L-02细胞和GES细胞的辐射防护作用及相关机制

摘要

研究背景：
　　电离辐射是指具有足够能量使物质的原子或分子产生电离作用的辐射，它广泛地存在于自然界及我们的生活环境中。机体受电离辐射后可诱导辐射生物学效应，小剂量的电离辐射能引起兴奋性效应和适应性反应，而大剂量的电离辐射作用机体时将引起机体损伤甚至死亡。为了减轻或缓解电离辐射对人体的损伤，人们期盼一种简单有效的电离辐射防护方法，因此，多年来科学家们一直在寻求高效低毒的电离辐射防护药物，且取得了很好的成绩。目前虽然有不少的抗放药，但与人们所期盼的防护药还存在很大的差距，从而使研发高效新型的防护药成为一个急需解决的课题。鉴于电离辐射引起严重生物效应的最初环节是导致产生大量的自由基，而氮氧自由基已经被证明具有强大的自由基清除能力，因而，我们课题组在前人研究的基础上，选择新近发展的一个的热点――氮氧自由基类的一个衍生物（氮氧自由基R-1）作为切入点，探讨其辐射防护作用及相关机制。
　　目的：
　　本课题采用新合成化合物氮氧自由基R-1，观察其对人肝细胞L-02和胃上皮细胞GES的辐射防护作用，并对相关机制作初步的探讨，旨在为开发新型的辐射防护药物奠定一定的实验基础。
　　方法：
　　应用MTT法测定氮氧自由基R-1对人肝上皮细胞L-02和胃上皮细胞GES在24、48和72h的毒性作用，筛选出合适氮氧自由基R-1的浓度进行后续实验。给予0、1、2、4、8Gy的60Co-γ射线照射后72h采用MTT法分别检测不同浓度的氮氧自由基R-1对L-02细胞和GES细胞活力的影响，同时设终浓度为4mmol/L组氨磷汀为阳性对照组。给予0、1、2、4、8Gy的60Co-γ射线于照射后的10d和12d采用克隆形成实验分别观察不同浓度的氮氧自由基R-1对L-02细胞和GES细胞的克隆形成的影响，同样设终浓度为4mmol/L组氨磷汀为阳性对照组。根据MTT法和克隆形成实验的结果，对于不同的细胞分别选用其防护效果最佳浓度组进行后续实验，即L-02细胞选用0.25μmol/L浓度组、GES细胞选用0.125μmol/L浓度组。将L-02细胞和GES细胞两种实验细胞各分成4组：①对照组(不接受辐照和药物处理)、②药物组（L-02细胞和GES细胞分别给予终浓度为0.25μmol/L和0.125μmol/L的氮氧自由基R-1的处理）、③照射组(接受4Gy的60Co-γ射线辐照处理)和④药物＋照射组(L-02细胞和GES细胞分别给予终浓度为0.25μmol/L和0.125μmol/L的氮氧自由基R-1作用30min后接受4Gy的60Co-γ射线辐照)。于4Gy的60Co-γ射线照射后的24、48和72h倒置显微镜下观察L-02细胞和GES细胞形态的变化、流式细胞仪检测两种细胞凋亡发生和Hoechst33258染色后荧光显微镜观察两种细胞核的变化。流式细胞仪检测各组细胞的周期，化学发光法检测超氧化物歧化酶（SOD）的活力、分光光度法检测谷胱甘肽（GSH）的活力、TBA法测定丙二醛（MDA）的含量和DCFH-DA法测量活性氧（ROS）含量；Westernblot检测各组P53、Bcl-2、Bax、Caspase-3的蛋白表达。
　　结果：
　　1、细胞毒性实验：与0μmol/L浓度组相比，当氮氧自由基R-1的浓度低于1μmol/L时，L-02细胞和GES细胞各时间点的吸光度（OD值）均无明显变化(P>0.05)，而浓度高于2μmol/L时，L-02细胞和GES细胞的吸光度（OD值）随浓度的增高下降明显(P<0.05)。故选用对细胞无毒性的0.1、0.125、0.25、0.5、1μmol/L的浓度组检测辐射防护作用。
　　2、细胞辐射防护实验：与0μmol/L组相比，氮氧自由基R-1各浓度组的L-02细胞和GES细胞的吸光值和克隆形成率均明显提高(P<0.05)，其中，L-02细胞以0.25μmol/L组的作用最明显，GES细胞以0.125μmol/L浓度组作用最明显。故L-02细胞采用0.25μmol/L浓度组，而GES细胞选用0.125μmol/L浓度组处理后续实验。
　　3、细胞形态学观察实验：与对照组相比，两种细胞药物组的形态和结构无明显改变。受4Gy的60Co-γ射线照射后，与照射组相比，药物＋照射组的L-02细胞和GES细胞均贴壁好，折光性强，轮廓清晰，微核数量、核碎裂数量以及凋亡和死亡的细胞数量均显著减少。
　　4、流式细胞仪检测细胞周期结果表明：与对照组的相同细胞相同时相相比，L-02细胞和GES细胞的药物组在各时相的变化不大，差异无统计学意义(P>0.05)。与照射组相比，两种细胞在药物+照射组的G2期阻滞缓解，差异有统计学意义(P<0.05)。
　　5、SOD、GSH、MDA和ROS的活力在各组中的变化：与对照组相比，L-02细胞和GES细胞药物组的SOD、GSH、MDA和ROS的变化不大，差异无统计学意义(P>0.05)。与照射组相比，两种细胞在药物+照射组的SOD和GSH的活力增强、而MDA和ROS的含量减少，差异有统计学意义(P<0.05)。
　　6、Westernblot检测：比较对照组，两种细胞药物组的四种蛋白的表达变化不明显，而照射组和药物+照射组的Bcl-2蛋白表达水平均下调，P53、Caspase-3和Bax蛋白表达水平均增加。与照射组相比，两种细胞药物＋照射组的Bcl-2蛋白的表达均上调，P53、Bax和Caspase-3的表达水平均下降。
　　结论：
　　氮氧自由基R-1能有效地防护60Co-γ射线对L-02细胞和GES细胞的辐射损伤，其防护作用可能通过清除L-02细胞和GES细胞内的自由基，缓解G2期阻滞，改变凋亡调控蛋白的表达等途径发挥其辐射防护作用。

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缩略语表

中文摘要

英文摘要

前言

文献回顾

一、 电离辐射的生物学效应

二、电离辐射的防护

三、实验研究目的

正文

第一部分 氮氧自由基 R-1 的辐射防护作用

1 引言

2 材料

3 方法

4 结果

5 讨论

第二部分 氮氧自由基 R-1 对 L-02 细胞和 GES 细胞辐射防护机制的研究

1 引言

2 材料

3 方法

4 结果

5 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢