Genistein介导的氧化应激对卵巢癌细胞顺铂敏感性的影响及其机制的研究

摘要

卵巢癌是妇科常见的恶性肿瘤，发病率仅次于宫颈癌，而病死率却高居榜首。以顺铂为基础的联合化疗在卵巢癌综合治疗中占有重要的位置，但由于肿瘤细胞耐药性的产生，限制了它的临床应用，成为卵巢癌复发转移及死亡率高居不下的主要原因。因此，寻求有效的耐药逆转剂或有效的化疗增敏剂是提高卵巢癌化疗疗效的关键环节。
　　Genistein主要是从豆类植物中提取的异黄酮类多酚化合物。因其结构与雌二醇相似，故也称之为植物雌激素。Genistein具有广泛的生物学活性，包括抗肿瘤，抗氧化，抗炎，改善心血管功能等，尤其在抗肿瘤方面，具有很大的潜能。近来研究表明，Genistein可以通过促进多种肿瘤细胞的凋亡来增加耐药肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，但其具体机制仍不清楚。
　　Genistein一直被认为是天然的抗氧化剂，是ROS的清除剂，很多研究也都集中在其抗氧化，清除氧自由基方面。但事实上Genistein不但具有抗氧化的作用，同时也具有促氧化的作用，而在抗肿瘤诱导肿瘤细胞凋亡方面，其促氧化作用更为重要。Genistein可能作为一个促氧化的代表，通过其介导的氧化应激刺激细胞内ROS的产生，而ROS与肿瘤细胞的凋亡密切相关，它可以通过介导DNA的片段化而诱导肿瘤细胞凋亡的发生。ROS在多种抗肿瘤药物诱导肿瘤细胞凋亡过程中起着介导和调节作用，顺铂发挥抗肿瘤的作用也依赖于ROS的产生。与正常细胞相比，肿瘤细胞清除ROS的能力较低，对ROS比较敏感。由此推断，通过刺激肿瘤细胞内ROS的产生，改变肿瘤细胞的氧化还原平衡状态，对DNA造成氧化损伤，从而启动细胞凋亡的发生，这可能是Genistein抗肿瘤的机理之一。基于以上分析，本课题初步研究了Genistein介导的氧化应激对卵巢癌细胞顺铂敏感性的影响及其可能作用机制。
　　研究目的
　　1.比较卵巢癌顺铂敏感株A2780及耐药株CP70细胞内ROS水平的差异，寻找两种细胞耐药差异与ROS的相关性。
　　2.探讨ROS在Genistein诱导的CP70细胞凋亡过程中的作用。
　　3.探讨Genistein介导的氧化应激对顺铂敏感性的影响及其可能作用机制。
　　研究方法
　　1.通过流式细胞术检测卵巢癌顺铂敏感株A2780和耐药株CP70细胞内的ROS水平。
　　2.采用MTT比色法检测不同浓度的Genistein对CP70细胞的增殖抑制作用。
　　3.通过流式细胞术检测不同药物处理后CP70细胞内ROS水平，线粒体膜电位的变化及细胞凋亡的情况。
　　4.利用免疫细胞化学法和Westernblot法检测不同药物处理后CP70细胞中Bcl-2，Caspase-3蛋白的表达水平。
　　5.ROS清除剂NAC干预后分别利用以上方法检测CP70细胞内ROS水平，细胞凋亡率，线粒体膜电位的变化及Bcl-2和Caspase-3蛋白的表达水平。
　　研究结果
　　1.顺铂敏感株A2780细胞内的ROS水平明显高于耐药株CP70细胞。
　　2.Genistein能以时间和剂量依赖的方式抑制CP70细胞的增殖，并能诱导其凋亡。
　　3.Genistein处理CP70细胞后，细胞内ROS水平明显增加，同时细胞凋亡率也随之增加，而线粒体膜电位反而降低。
　　4.Genistein和顺铂合用组与顺铂单用组相比，CP70细胞内的ROS水平和细胞凋亡率均升高，线粒体膜电位降低。
　　5.Bcl-2和Caspase-3在CP70细胞内呈浆核共表达。Genistein和顺铂合用与顺铂单用相比，CP70细胞内Bcl-2的表达降低，Caspase-3的表达增高。
　　6.ROS清除剂NAC的干预抑制了ROS水平的增加，抑制了线粒体膜电位的降低，同时也使CP70细胞的凋亡率降低，Bcl-2蛋白的表达升高，而Caspase-3蛋白的表达降低。
　　结论
　　1.顺铂敏感株A2780和耐药株CP70细胞内的ROS水平存在差异，这可能是这两种细胞对顺铂敏感性不同的原因之一。
　　2.Genistein能以时间和剂量依赖的方式抑制CP70细胞的增殖，并能诱导其凋亡，ROS在其中发挥着重要的作用。
　　3.Genistein介导的氧化应激可以通过降低Bcl-2蛋白的表达，增加Caspase-3蛋白的表达来增加耐药株CP70细胞对顺铂的敏感性，这可能是其抗肿瘤增加顺铂敏感性的机理之一。

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缩略语表

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前言

文献回顾

一、卵巢癌铂类耐药机制的研究进展

二、Genistein 及其抗肿瘤作用研究进展

三、ROS 与细胞凋亡

正文

实验一 卵巢癌顺铂敏感株 A2780 及耐药株 CP70细胞耐药差异与 ROS 的相关性

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 Genistein 对卵巢癌耐药株 CP70 细胞增殖凋亡的影响及其与 ROS 的相关性

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验三 Genistein 介导的氧化应激对顺铂敏感性的影响及其机制研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢