人硫氧还蛋白与ASK1的结合同硫氧还蛋白氨基酸位点的关系

摘要

实验背景及研究目的：
　　ASK1(Apoptosis signal-regulating Kinase)属于MAPK(Mitogen-activated protein Kinase)家族中的一员，可以被多种氧化物质、TNF-α等磷酸化并激活，通过JNK及p38通路诱导细胞凋亡。从而在多种疾病包括心血管疾病的发生发展过程中起关键的致病性作用。
　　硫氧还蛋白（Trx,thioredoxin）是一种分子量为12KDa的小分子蛋白，几乎表达于所有的活细胞中1，具有重要的抗氧化、抗凋亡的作用。它的结构特点是其氧化/还原中心含有这样的一个氨基酸序列：Trp-Cys-Gly-Pro-Cys-Lys。其32、35位的两个半胱氨酸残基可以形成一个巯基，是其发挥氧化还原及抗凋亡作用的结构基础。大量的研究发现：Trx可以与ASK1直接结合，抑制ASK1的促凋亡作用，这一作用的发挥也是与它活性中心的32、35位的半胱氨酸残基密切相关的。Trx是由105个氨基酸位点组成，目前认为其活性中心的32、35位的两个半胱氨酸位点与其生物学功能密切相关，其69位及73位的半胱氨酸位点也可影响的Trx与ASK1的结合。是否还有其它氨基酸位点影响Trx与ASK1的相互作用，进而影响Trx的氧化还原及抗凋亡作用的发挥，目前不得而知。研究表明氧化物质如H2O2可以影响Trx与ASK1的结合，使Trx与ASK1发生解离，进而影响ASK1的促凋亡作用。但是在H2O2作用下，突变不同氨基酸位点的Trx与ASK1的解离程度是否也有所不同，进而影响到Trx的抗凋亡作用，目前尚不清楚。本文通过突变Trx32、35及49位的氨基酸位点，分别与ASK1共转染后，观察各组细胞凋亡程度是否不同；如果各组细胞凋亡程度有差异，进一步研究造成这一差异的机制是否与不同突变体的Trx同ASK1的结合能力不同有关。
　　实验方法:
　　第一部分：质粒的构建及转染：构建WT-Trx-Histag（TrxA，野生型Trx）、hTrx-C32S-Histag(TrxB，Trx32位的半胱氨酸突变为丝氨酸)、hTrx-C35S-Histag(TrxC,Trx35位的半胱氨酸突变为丝氨酸)、hTrx-Y49F--Histag(TrxD，Trx49位的酪氨酸突变为苯丙氨酸)突变体的质粒。将HEK293A细胞传入12孔板中，培养24小时后当细胞密度达到80％时，进行转染。用Opti分别稀释HD转染试剂及质粒Trx及其各突变体与质粒ASK1-HAtag(ASK1)的混合物（Trx：ASK14：1），室温放置15min，共转染入293A细胞中，5％CO2，37℃孵箱孵育。转染24小时后用lysis buffer A裂解细胞，提取蛋白。在提取蛋白前20min加入不同浓度(0,0.5,1,2mmol/L)的H2O2干预20min。
　　第二部分：Trx及其突变体与ASK1的相互作用：实验分为对照组（CON组），ASK1转染组，TrxA与ASK1共转染组，TrxB与ASK1共转染组，TrxC与ASK1共转染组，TrxD与ASK1共转染组。共转染24小时后检测以下指标：心肌细胞凋亡（TUNEL法）、Caspase-3活性。加入H2O2干预20min后，通过免疫共沉淀法检测Trx及其各突变体与ASK1的解离程度，进一步探讨Trx及其各突变体在抑制ASK1的促凋亡作用方面的机制。
　　实验结果:
　　1.成功构建TrxA、TrxB、TrxC、TrxD质粒。
　　2.成功转化、扩增及提取ASK1、TrxA、TrxB、TrxC、TrxD质粒。
　　3.与未转染入任何质粒组比较，转染入ASK1组的细胞凋亡指数及Caspase-3活性明显增加（P＜0.01），与转染入ASK1组比较，转染入TrxA组细胞凋亡指数及Caspase-3活性减少（P＜0.05），而转染入TrxB组，TrxC组及TrxD组，细胞凋亡指数及Caspase-3活性减少更明显（P＜0.01），但是后三者之间无明显统计学差异。
　　4.在H2O2干预下，TrxB与ASK1，TrxC与ASK1及TrxD与ASK1的结合较TrxA与ASK1的结合更加紧密，即ASK1从前三种复合物中更不易被解离出来。
　　实验结论：
　　1.Trx发挥抗凋亡作用的机制是：Trx与ASK1结合后，抑制了ASK1促细胞凋亡的作用。
　　2.Trx与ASK1的结合能力与Trx中的不同氨基酸位点密切相关，除第32、35位的半胱氨酸位点外，第49位的酪氨酸位点也参与调节Trx与ASK1的结合。
　　3.H2O2可促使Trx与ASK1解离，但因为突变的Trx中的氨基酸位点不同，从而可影响其与ASK1的解离程度，进而影响Trx的抗凋亡作用。
　　4.Trx49位的酪氨酸突变为苯丙氨酸后，Trx与ASK1的结合能力较野生型增强，Trx抗凋亡的作用明显增加。

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缩略语表

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前言

文献回顾

1.细胞凋亡

2.ASK1 与细胞凋亡

3.Trx 与细胞凋亡

正 文

第一部分：TrxA 及其各突变体质粒的构建、转化、扩增及提取

1 目的

2 材料

3 实验方法

4 结果

5 讨论

第二部分 Trx 及其突变体与 ASK1 的相互作用

1 目的

2 材料

3 实验方法

4 结果

5 讨论

小结

参考文献

个人简历

致谢