人脐静脉内皮细胞永生化细胞系的建立、鉴定及应用

摘要

【背景】
　　肿瘤的治疗是目前全世界面临的难题，传统的放疗、化疗及手术治疗疗效欠佳，探索新的肿瘤治疗方法成为医学研究领域的当务之急。1971年Folkman教授提出了肿瘤血管依赖性理论。自此之后，肿瘤血管抑制治疗成为肿瘤领域的研究热点，并且取得了一些成果。但是，由于缺少肿瘤血管的靶向性分子，临床治疗效果不理想。而肿瘤血管与正常血管相比存在“异质性”的研究使得肿瘤血管的靶向治疗成为可能。
　　在前期的工作中，我们建立了人低分化胃腺癌的肾包膜下异种移植瘤模型，利用噬菌体随机展示肽库进行体内筛选，在荷瘤鼠体内成功筛选出了能与胃癌血管特异性结合的环七肽GX1(CGNSNPKSC)。实验证实，GX1对胃癌的血管具有良好的靶向性并且能够在一定程度上抑制血管生成,具有良好的应用前景。目前肿瘤血管抑制治疗多采用内皮细胞与肿瘤细胞体外共培养模型，内皮细胞多采用来源广泛、易于获得的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)。但是由于原代人脐静脉内皮细胞分离工作量大，体外培养传代有限等限制了这一领域的研究。因此本课题就围绕人脐静脉内皮细胞永生化细胞系的建立、鉴定及应用展开，以期成功建立HUVECs的永生化细胞系，为GX1后续研究及肿瘤的血管抑制治疗提供一个很好的细胞模型。
　　【目的】
　　获得HUVECs的永生化细胞系，从而为GX1后续研究及肿瘤的血管抑制治疗提供一个很好的细胞模型。
　　【方法】
　　1.通过胶原酶消化法分离原代的脐静脉内皮细胞（HUVECs）。
　　2.通过慢病毒介导SV40LT感染原代HUVECs。
　　3.通过电镜观察、免疫细胞荧光化学、RT-PCR及管状成形试验等方法从形态学、特征性标志物的表达等方面对原代及转染后的HUVECs进行鉴定。
　　4.利用免疫荧光化学及IP的方法验证GX1的受体在永生化HUVECs上的表达，从而证实永生化HUVECs可作为一种新的细胞模型用于肿瘤血管抑制治疗的研究。
　　【结果】
　　1.成功分离培养了原代的HUVECs。在相差倒置显微镜下，分离的细胞呈单层生长，呈多角形或短梭状；扫描电镜及透射电镜下，细胞表面多绒毛及凸起，且发现内皮细胞的特征性结构W-P小体；八因子及KDR染色阳性；管状形成试验阳性。
　　2.成功包装SV40LT的慢病毒载体，并转染入HUVECs，转染后的HUVECs可以持续传代，形态学、特征性标志物及管状形成试验与原代HUVECs无明显差异；RT-PCR证实SV40LT成功转入，且原代与转染后的HUVECs八因子及KDR的表达在mRNA水平无明显差异。
　　3.免疫荧光化学及IP结果均证实永生化HUVECs上有GX1受体的表达，其可以替代原代HUVECs用于GX1的相关研究。
　　【结论】
　　1.慢病毒介导的SV40LT可以成功诱导HUVECs永生化。
　　2.永生化HUVECs可以作为一种新的细胞模型用于肿瘤血管抑制治疗。

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封面

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缩略语表

中文摘要

英文摘要

前言

文献回顾

一．肿瘤的血管抑制治疗

二．SV40LT

三．慢病毒载体（LV）

四．GX1 的研究进展

正文

第一部分 原代脐静脉内皮细胞的分离与鉴定

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分 人脐静脉内皮细胞永生化细胞系的建立与鉴定

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第三部分 永生化 HUVECs 的应用

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢