KAI1基因抑制胰腺癌淋巴转移的作用及其相关机制的研究

摘要

【背景】
　　胰腺癌恶性程度极高，早期即可发生转移，易产生抗药性。临床患者确诊后只有10％～15％可手术切除，5年生存率也仅为1％～5％。目前的研究表明胰腺癌的淋巴转移是影响治疗和预后的重要因素之一。有效的预防和控制胰腺癌的淋巴转移，在探索胰腺癌的有效治疗方法及提高综合治疗效果中有重要的意义。近年来，随着淋巴管示踪技术及淋巴管特异性标记技术的发展，以及对包括癌细胞的迁移、侵袭、淋巴管新生、侵入淋巴管等多个部分组成的肿瘤淋巴转移过程的逐渐明确，肿瘤淋巴转移的研究取得了一定的进展。但是，胰腺癌向淋巴转移的具体机制尚不清楚，针对性的靶向治疗也较少报道，相关研究已成为国内外的研究热点。
　　KAI1基因全称KangAi1基因，是新近发现的一种抑癌基因，其编码的跨膜蛋白属于跨膜4超家族（TM4SF）。目前在包括胰腺癌在内的多种肿瘤的研究显示，KAI1在肿瘤转移过程中可发挥调节细胞黏附和运动，抑制肿瘤细胞迁移和侵袭等多种作用，相关作用机制的研究也在进一步开展。此外，临床病理研究中还发现，KAI1基因的表达与多种肿瘤的淋巴转移呈负相关。我们以往的研究也首次在发生淋巴转移的胰腺癌组织中发现了KAI1基因的低表达。因此，KAI1基因在胰腺癌淋巴转移中可能具有重要的调控作用。
　　【目的】
　　探讨KAI1基因在胰腺癌细胞淋巴转移的调控作用与分子机制。
　　【方法】
　　1．采用真核质粒转染KAI1基因，并通过Western-Blot技术验证，构建高表达KAI1基因的人胰腺癌MIAPaCa-2细胞系；2．通过MTT检测KAI1对胰腺癌细胞增殖的影响；3．借助划痕实验和TransWell小室观察KAI1高表达后胰腺癌细胞迁移能力的变化；4．通过Western-Blot技术检测KAI1对迁移相关因子蛋白表达的调控；5．建立人胰腺癌皮下成瘤动物模型，观察KAI1对胰腺癌肿瘤生长及淋巴转移的作用；6．通过免疫组化技术检测不同瘤体组织中淋巴管特异性标志物LYVE-1，计算微淋巴管密度；7．采用Westernblot及ELISA技术检测KAI1对胰腺癌细胞淋巴管生成因子的作用；8．采用Westernblot技术研究KAI1对淋巴管内皮细胞生长因子调控作用的信号转导通路。
　　【结果】
　　1．经G418筛选，利用WesternBlot方法检测到KAI蛋白表达明显增高，成功建立了KAI1高表达的人胰腺癌细胞系MIAPaCa-2-K。
　　2．KAI1基因对胰腺癌细胞的增殖无显著影响。划痕实验发现在24h、48h、72h时间点KAI1均可抑制胰腺癌细胞的迁移。Transwell小室实验中，MIAPaCa-2、MIAPaCa-2-p、MIAPaCa-2-K迁移24小时后，迁移细胞数分别为48±15.4、50±12.4、12±3.8，组间具有统计学差异（p＜0.05）。
　　3.Westernblot实验发现相对于胰腺癌细胞MIAPaCa-2和MIAPaCa-2-p，MIAPaCa-2-K细胞中E-粘连素的蛋白表达增加，而MMP9、MMP2的蛋白表达水平下降。
　　4.人胰腺癌裸鼠皮下成瘤发现MIAPaCa-2和MIAPaCa-2-p组成瘤率为100％，MIAPaCa-2-K组为70％。通过绘制肿瘤体积生长曲线发现KAI1对裸鼠皮下移植瘤的生长无明显抑制作用。
　　5.皮下接种50d后处死裸鼠，获取瘤体，MIAPaCa-2组重量为1364.40±211.30mg，MIAPaCa-2-p组重量为1426.13±175.10mg，MIAPaCa-2-K组为1294.37±195.40mg，组间无显著差异（p＞0.05）。
　　6.解剖裸鼠，发现MIAPaCa-2组8只出现淋巴结转移，裸鼠平均淋巴结转移数2.47个/只；MIAPaCa-2-p组7只出现淋巴结转移，裸鼠平均淋巴结转移数2.14个/只；MIAPaCa-2-K组3只出现淋巴结转移，裸鼠平均淋巴结转移数1.33个/只；组间差异具有统计学意义（p<0.05）。
　　7.观察肿瘤组织中LYVE-1免疫组织化学染色发现，MIAPaCa-2-K组微淋巴管密度为12.20±3.30，显著低于MIAPaCa-2组的28.30±5.22和MIAPaCa-2-p组的30.50±4.68，p<0.05。
　　8.Westernblot实验发现相对于胰腺癌细胞MIAPaCa-2和MIAPaCa-2-p，MIAPaCa-2-K细胞中VEGF-A的蛋白表达无显著差异，而VEGF-C的蛋白表达水平明显下降。ELISA实验发现胰腺癌MIAPaCa-2-K细胞培养上清中的VEGF-C含量显著低于MIAPaCa-2和MIAPaCa-2-p细胞，p<0.05。
　　9.Westernblot实验显示KAI1基因的高表达可抑制胰腺癌细胞Src及STAT3的磷酸化。分别应用Src或STAT3相应信号通路阻断剂均可降低胰腺癌细胞MIAPaCa-2中VEGF-C的蛋白表达。Src的阻断剂可以抑制STAT3的磷酸化而STAT3的阻断剂不能抑制Src的磷酸化。
　　【结论】
　　1．高表达KAI1可促进胰腺癌细胞中E-粘连素的蛋白表达，抑制MMP9、MMP2的蛋白表达来抑制胰腺癌细胞的体外迁移。
　　2．KAI1可减少动物模型皮下成瘤组织中淋巴管新生，降低微淋巴管密来抑制胰腺癌的淋巴转移。这种抑制作用可能是通过调控Src/STAT3信号通路的磷酸化，抑制胰腺癌细胞VEGF-C的合成来实现的。
　　3．上述结论证明了KAI1基因在胰腺癌的淋巴转移过程有重要的调控作用，提示其在胰腺癌治疗中具有较好的应用前景。

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缩略语表

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前言

文献回顾

第一部分 胰腺癌淋巴管新生的研究进展

一、淋巴系统功能及结构特点

二、淋巴管的特异性识别

三、淋巴管新生的分子机制及其信号传导

四、淋巴管新生的调控

五、肿瘤淋巴转移与淋巴管新生的机制研究进展

六、胰腺癌淋巴管新生的研究

第二部分 KAI1 基因与肿瘤转移机制的研究进展

一、KAI1 基因的结构特点及调控

二、KAI1 基因抑制肿瘤转移的分子机制

三、KAI1 基因在胰腺癌转移中的研究进展

四、结语

正文

KAI1基因对胰腺癌淋巴转移的作用及其相关机制的研究

第一部分KAI1 基因对胰腺癌细胞生物学行为影响的研究

1 材料和仪器

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分KAI1 基因对裸鼠胰腺癌模型肿瘤淋巴转移的影响

1 材料和仪器

2 方法

3 结果

4 讨论

第三部分KAI1 抑制胰腺癌淋巴管新生的分子机制研究

1 材料和仪器

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢