应激性PKC在心肌肥厚向心力衰竭转化中的作用

摘要

蛋白激酶C（proteinkinaseC，PKC）是一种多功能的丝氨酸苏氨酸激酶，不仅在细胞的跨膜信号转导中起重要作用，而且在心肌肥厚过程中是主要介导分子，在心肌代偿性肥厚转向心力衰竭的过程中扮演双重角色[1]。长期慢性压力超负荷（如原发性高血压）导致心肌发生代偿性肥厚，可致使心肌收缩性能增强，而室壁应力降低[2]。但如不采取适当干预措施，致使压力超负荷的病理性刺激因素长期存在[3]，过度心肌肥厚将导致心功能由代偿阶段向失代偿阶段转化，最终导致心力衰竭。此转化过程中，究竟何种PKC起主导作用，或是哪几种PKC亚型相互协作共同调节这一过程，PKC各亚型间关系如何，以及它们在心肌肥大转向心衰中的作用机制如何是我们关注的焦点。
　　本实验室通过分离成年大鼠心肌细胞，获取了成年大鼠心肌细胞在不同电刺激频率下收缩的正常指标，并对心肌细胞分别进行PKC激动剂和抑制剂灌流，发现PKC激动剂能引起负性肌力改变，而PKC抑制剂则能使心肌细胞收缩性能增强[4]。本实验室的既往研究从细胞层次和微观角度观察了PKC和心肌细胞收缩功能之间的关系，其机制有待进一步探究。我们将大鼠心肌在应激条件下反应性表达增多的PKCα、PKCβⅠ和PKCβⅡ称之为应激性PKC[5]。本文采取离体工作心脏、单个心肌细胞分离、在体大鼠颈动脉血压测量、WesternBlot和免疫荧光组化、细胞转染以及活体大鼠siRNA转染等多角度多层次的方法，对1w、8w、16w和20w腹主动脉缩窄(transverseabdominalaorticconstriction，TAC)导致高血压大鼠的心脏功能进行检测，主要结果如下：
　　1.TAC大鼠心肌不同程度肥厚和心功能降低，长期压力超负荷持续作用促使心肌肥厚向心力衰竭转化。对实验组和同步对照组进行离体工作心脏灌流，在固定负荷（前负荷10mmHg，后负荷60mmHg）下，1w和8wTAC组大鼠心输出量(cardiacoutput,CO)和固有心率(intrinsicheartrate,IHR)与其对照组相比无明显差异；用100nMPKC非特异激活剂PMA（Phorbol-12-myristate-13-acetate，佛波酯）作用10min之后，TAC组大鼠CO和IHR略低于对照组,可见激活PKC可抑制心脏功能。16wTAC大鼠心脏CO和IHR都较同步对照组有显著增加，且CO增加幅度比IHR更大，使每搏输出量（SV，srtrokevolum）代偿性增加,可见16wTAC大鼠心脏功能处于代偿性功能增强阶段；100nMPMA作用之后，TAC组大鼠由代偿转向心衰。20wTAC大鼠心功能在高血压因素持续作用下已由代偿期转向失代偿，CO较对照组明显减少，IHR却显著加快，因此每搏输出量（strokevolume，SV）急剧减少；100nMPMA作用之后，TAC大鼠的心衰更加显著。TAC大鼠左心室舒张末期压力（leftventricularend-diastolicpressure,LVEDP）高于同期对照组，心室内压力最大舒张速度（maximalrateofleftventricularpressurerelaxation,-dP/dtmax）较对照组明显减慢，说明TAC大鼠心脏的舒张功能受到严重损伤，随着心衰程度的加深，心室舒张越加迟缓。灌流结束后称量心脏重量，发现心室质量/体重比随TAC时间延长逐渐增高。
　　2.长期压力超负荷作用下TAC大鼠心肌收缩和舒张功能受损，高心率条件下舒张功能受损更严重。离体工作心脏灌流后发现，20wTAC大鼠左心室LVEDP高于同期对照组，-dP/dtmax较对照组明显减慢，说明TAC大鼠心脏的舒张功能受到损伤，随着心衰程度的加深，心室舒张越加迟缓。由前述结果可知，16w大鼠心脏处于代偿性功能增强阶段，而20w大鼠心脏已转向心衰。因而依次给16wTAC大鼠离体工作心脏300beats/min,360beats/min和420beats/min的电刺激，同时联合以100nMPMA灌流10min，CO随着电刺激频率的增加先轻微增加后显著减少。在其他组别的实验动物中没有发现此现象。推测原因可能是16wTAC大鼠心脏在360beats/min电刺激下出现一个轻微的频率依赖性舒张功能增强性CO增加，即在适度频率增加的情况下，心脏舒张功能增强，回心血量增加。但在PMA广泛激活肥厚心肌中过表达的PKC的情况下，更高频率刺激（如本实验中420beats/min的电刺激）使心动周期缩短更甚，由于心脏舒张时间占整个心动周期的3/4，所以高频刺激下肥厚心脏的舒张不全更加严重，使CO急剧减少。
　　3.TAC大鼠心肌细胞PKCα向膜结构转位增强，提示在高血压大鼠心肌肥厚和由心肌肥厚转向心衰过程中，PKCα可能起重要作用。文献报道在心肌肥厚过程中，PKC起重要作用。用免疫组化和激光扫描共聚焦显微镜对分离出16w和20w大鼠单个心肌细胞进行染色和观察，结果显示：16w、20wTAC大鼠心肌细胞PKCα向膜结构转位增强，且在20wTAC较在16wTAC更加明显。用PMA孵育心肌细胞后，发现心肌细胞中PKCα转位较同组不孵育时明显。对心肌细胞进行其他PKC亚型的免疫组化染色，未发现明显的改变。PKC向细胞膜结构转位可视作激活的标志，未经激活的PKC位于心肌细胞的胞浆中，一旦PKC被激活，就会向膜结构转位。在心肌肥厚向心力衰竭转化的过程中，PKCα激活显著增强，这一结果提示在TAC大鼠心脏由肥厚转向心衰的过程中，PKCα可能起了重要作用。
　　4.TAC大鼠心肌各PKC亚型蛋白与钙转运相关蛋白表达的改变。WesternBlot结果显示，1w和8w大鼠心肌匀浆各PKC亚型和兴奋-收缩偶联相关蛋白表达未有明显改变。而16w和20w大鼠心肌匀浆PKCα表达较同期对照组明显增加。PKCβⅠ和PKCε表达也较同期对照有所增加，但这两种亚型转位激活并未见明显改变。筛查心肌细胞兴奋-收缩偶联关键蛋白，发现L-型Ca2+通道蛋白表达在各组别未见明显改变。TAC组大鼠心肌细胞匀浆受磷蛋白PLB磷酸化总水平较各自对照组略有降低，且20w较16w降低更明显。PLB-17位磷酸化水平无明显改变，而TAC组PLB-Ser16位磷酸化水平较同期对照组降低。而受PLB磷酸化水平调节的心肌SERCA2α蛋白表达变化如下：16wTAC大鼠心肌SERCA2α表达较对照组增加，而20wTAC大鼠心肌SERCA2α表达较对照组减少。
　　由此推测：TAC大鼠心脏在长期压力超负荷条件下，通过一系列调节，导致心肌PKCα过表达或激活，使心脏收缩和舒张功能受损，特别是心脏舒张功能。舒张功能在代偿性高心率下受损更加严重。高血压因素持续存在，最终导致心力衰竭。有研究报道心肌PKCα过度表达的转基因小鼠中，心肌细胞中的PKCα过度表达或激活能磷酸化I-1蛋白，从而抑制PLB-16位丝氨酸磷酸化，影响心肌细胞SERCA2α活性，导致ATP酶活性降低，肌质网钙泵和Ca2+亲和力降低以及肌质网钙摄取功能障碍，从而影响了心肌舒张功能，致使CO下降。这可能是PKC调节心脏舒缩功能的机制之一。本文试图从活体大鼠PKCα-siRNA转染出发，进一步完善实验。初步结果如下：
　　1)使用invivo-jetPEI活体转染试剂和带有绿色荧光基团的siRNA试剂混合，注入大鼠股静脉。摸索最佳转染时间，并在激光共聚焦显微镜下观察分离出的该大鼠单个心肌细胞，发现该种转染试剂确实可将基因序列转入心肌细胞中，并排除了心肌自发荧光对观测的影响。
　　2)HEK293细胞能恒定表达PKCα，且易于转染。本实验培养肾源性HEK293细胞，并用Lipofectamine2000作为载体将目的siRNA转入细胞中。筛选沉默效率最高的PKCα-siRNA序列。确定最佳转染时间和最佳转染浓度。
　　3)大鼠活体siRNA转染成功后用离体工作心脏、WesternBlot来检验特异性沉默PKCα的效果。
　　综上所述，大鼠心脏在长期压力超负荷作用下，导致心肌细胞中PKCα过度表达或激活，通过一些中间环节作用传递间接降低PLB-16位丝氨酸磷酸化水平，影响SERCA2α的活性，导致肌质网钙摄取功能障碍，心肌细胞胞浆中的钙离子水平在心肌收缩后不能迅速降低，影响了心肌舒张功能，在高心率下尤甚。在心肌肥厚向心衰过转化过程中，应激性PKC特别是PKCα起了重要作用。

目录

封面

声明

目录

缩略语表

中文摘要

英文摘要

前言

文献回顾

PKC 表达与心肌肥厚和心衰的关系

PKC 的分子结构

PKC 在心肌细胞中的定位

PKC 调节心脏功能的分子基础

PKC信号转导通路

PKC在心肌肥厚向心力衰竭转化过程中的作用

正文

实验一 TAC 大鼠心功能动态变化

1 引言

2 实验方法

3 结果

4 讨论

实验二 TAC 大鼠心肌 PKCs与兴奋-收缩偶联关键蛋白的变化

1 引言

2 实验方法

3 结果

4 讨论

实验三 在体 siRNA 转染下调 PKCα 对 TAC 大鼠心功能影响的探索

1 引言

2 实验方法

总结与展望

参考文献

个人简历和研究成果

致谢