Tamoxifen通过下调miR-200家族表达促进子宫内膜癌细胞上皮间质转化的机制研究

摘要

TAMOXIFEN（他莫昔芬，TAM）作为雌激素竞争拮抗剂能够与乳腺细胞的雌激素受体结合，对依赖雌激素生长的乳腺癌细胞起到抑制的作用，它已经被应用治疗雌激素受体阳性的乳腺癌患者。但是研究表明，TAM在子宫组织中可以表现出拟雌激素的作用，从而诱发组织中肿瘤的发生。例如，雌激素是诱发子宫内膜癌的一个关键因素，虽然TAM拟雌激素的作用对于绝经期的妇女可以有效的维持骨量，但是却能够提高子宫内膜癌的发病率，诱发子宫内膜发生增生、息肉、癌、肉瘤等多种病理改变。
　　MicroRNA(miRNA)是由约22个核苷酸组成的非编码单链RNA，它们能够在转录后水平通过与靶mRNA3'非编码翻译区碱基形成特异性互补配对，抑制靶基因的翻译或降低mRNA的稳定性，从而沉默或干扰靶基因的表达。近些年来miRNA被发现在胚胎的发生和肿瘤调控等复杂的生理过程中发挥了重要的作用。
　　miR-200在调控上皮间质变(EMT)过程发挥了重要的作用，影响肿瘤的发生和转移。miR-200家族能够通过直接抑制靶基因ZEB1和ZEB2来上调E-cadherin的表达，从而抑制了EMT的发生。在本研究中，我们探索了miR-200这个EMT过程中发挥重要作用的miRNA分子在TAM作用的子宫内膜癌细胞系中的作用及其相关调控机制。
　　首先，我们发现子宫内膜癌细胞系ECC-1在TAM的作用下发生了EMT的转化。ECC-1细胞是一类雌激素依赖的子宫内膜癌细胞系。我们通过实时定量的方法验证，ECC-1在TAM的刺激下，EMT相关的标记分子的mRNA水平发生了明显的变化，出现了向间质细胞转化的趋势。划痕试验和细胞侵袭试验也验证细胞在TAM的作用下，细胞的迁移和侵袭能力有明显的增强。
　　为探索miRNAs在TAM诱导子宫内膜癌细胞发生EMT过程中的作用，我们用miRNAs表达谱芯片检测了TAM刺激ECC-1细胞前后有明显差异的miRNAs。发现了4种miRNAs显著的上调，19种miRNAs显著的下调。其中miR-200b分子已被证实在乳腺癌等肿瘤中能够促进EMT，并在这些肿瘤的发生和转移过程中发挥了重要的作用。为阐明TAM诱导子宫内膜癌细胞发生EMT的分子机制，我们把miR-200分子作为后续实验的研究对象，深入研究了miR-200与ECC1发生EMT的关系及miR-200自身的调控机制。
　　根据生物信息学软件TargetScan预测ZEB2为miR-200家族的靶基因，我们通过双荧光素酶报告实验证实miR-200b能够结合ZEB2的3'UTR。在ECC-1细胞中过表达miR-200b能够上调E-cadherin和下调Snail和N-cadherin等EMT重要基因的表达。miR-200b能够明显抑制TAM刺激的ECC-1细胞的侵袭能力。
　　我们接下来阐明了TAM刺激ECC-1细胞调控miR-200b-200a-429启动子的相关机制。首先我们克隆出miR-200b-200a-429启动子的荧光素报告载体，利用生物信息学软件TESS对miR-200b-200a-429的启动子序列进行了分析，发现了启动子区域有c-Myc,c-Myb,sp1等重要转录因子的结合位点。我们进一步用实验表明c-Myc能够特异性的结合miR-200b-200a-429的启动子并对其活性有明显的抑制作用。而且我们发现TAM能够上调ECC-1细胞中c-Myc的表达。
　　综上所述，我们确定了miR-200家族作为一个重要的因子在TAM诱发子宫内膜癌变中可能发挥了重要的作用。TAM通过上调c-Myc来抑制miR-200的表达，miR-200表达的下降导致靶基因ZEB2的上调，转录因子ZEB2上调引起E-cadherin的下调，使细胞间的粘附作用减弱，促进肿瘤细胞的转移和侵袭。本研究证实了TAM能够促进子宫内膜细胞发生EMT，阐明了miR-200在此过程中的作用机制，揭示了c-Myc对miR-200的直接调控作用，明确了TAM-c-Myc-miR-200-靶基因这一信号传导通路，为深入理解TAM诱发子宫内膜癌的分子机制提供了新的线索。

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缩略语表

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前言

文献回顾

第一部分 EMT 与肿瘤的发生

1 .EMT的概念

2 EMT的相关分子机制

3 调控EMT的信号通路

4 雌激素与EMT

5.小结

第二部分 miRNA 研究进展

1．miRNA的发现

2．miRNA在生物体内的合成

3．miRNA的作用机制

4．miRNAs靶基因的预测与确定

5．miRNAs的生物学作用

6．小结

正文

实验一 TAM 促进子宫内膜癌细胞系 ECC-1 发生上皮细胞间质转化

1 材料

2 方法

3.结果

4 讨论

实验二 TAM 抑制 ECC-1 细胞中 miR-200 家族的表达

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验三 miR-200b 通过下调 ZEB2 的表达抑制子宫内膜癌 ECC-1 细胞发生 EMT

1 材料

2 方法

3.结果

4 讨论

实验四 TAM 在子宫内膜癌 ECC-1 细胞中通过c-Myc 直接抑制 miR-200 的表达

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢