利用羊膜上皮细胞和羊膜间充质细胞构建组织工程皮肤并修复裸鼠创面缺损

摘要

近年来，组织工程皮肤的发展取得了很大的进展，有不少组织工程皮肤替代物已经应用于临床并取得了一定的修复创面的效果。许多学者认为干细胞在组织工程皮肤修复创面的过程中取到了很重要的作用，目前已有学者采用出成体干细胞如脂肪间充质干细胞(ADSCs)，骨髓间充质干细胞(BMMCs)，表皮干细胞(ESCs)作为组织工程种子细胞，构建组织工程皮肤并用于修复创面缺损，取得了比普通的皮肤细胞更好的修复效果。但是构建组织工程皮肤需要大量的种子细胞，上述细胞的来源和数量是制约含干细胞的组织工程皮肤产品实现产业化临床应用的主要障碍之一。近年来研究发现羊膜细胞具有干细胞特性，理论上可以分化成各种组织细胞，它的这些特点使其作为其他干细胞的替代物而引起广泛的关注。
　　从羊膜分离培养的细胞包括羊膜间充质细胞(Human amniotic mesenchymal cells,HAMCs)和羊膜上皮细胞（Human amniotic epithelial cells,HAECs），研究证明从羊膜来源的细胞表达干细胞表面标志物并且具有分化成三个胚层细胞的能力。羊膜上皮细胞的表面标志物如CD29、CD105、CD73、胚胎表面抗原（SSEA）3和4、肿瘤抑制抗原1-60、1-81（TRA1-60、TRA1-81）阳性表达，而SSEA-1、CD34和CD133等是阴性表达，除了细胞表面抗原，羊膜上皮细胞还表达多能干细胞的分子标志物，比如转录结合蛋白4（OCT-4）和Nanog。羊膜间充质细胞的免疫表型则与骨髓来源间质干细胞相似CD90、CD105、CD166、CD49e和人类白细胞抗原（HLA）ABC阳性而CD31、CD34、CD45、CD49d、CD123和HLA-DR阴性，且其比骨髓来源的间质干细胞具有更强的扩增能力。羊膜上皮细胞和羊膜间充质细胞都可以抑制人外周血单个核细胞增殖，而且呈剂量依赖关系。羊膜是产后废弃物，容易取材，羊膜细胞可以在体外大量分离培养，它们的应用不引起伦理学争议。所有以上特点表明羊膜细胞在移植和再生医学应用中有望成为组织工程种子细胞的新的理想来源。
　　目的：本实验研究人羊膜间充质细胞和羊膜上皮细胞的分离、培养及其干细胞特性，并利用羊膜间充质细胞和羊膜上皮细胞构建组织工程皮肤修复裸鼠创面缺损，为羊膜间充质细胞和羊膜上皮细胞在再生医学的潜在应用奠定实验基础。
　　方法：无菌条件下取正常足月剖腹产胎儿的羊膜剪成碎片，经胰酶胶原酶序贯消化，DMEM培养，倒置显微镜下观察其形态，免疫荧光的方法对两种细胞进行鉴定，流式细胞仪（FCM）检测表面分子，定向诱导方法检测细胞的多向分化潜能；利用羊膜间充质细胞复合胶原构建组织工程真皮组织，再在其上种植羊膜上皮细胞，形成双层组织工程皮肤，含细胞的胶原基质先在液下培养3天，然后移到气液面培养2周，构建好的组织工程皮肤最后用于修复裸鼠创面。
　　结果：来源于羊膜的上皮细胞和间充质细胞，细胞免疫荧光显示SSEA-4、OCT-4阳性，具有很强的增殖能力，流式细胞仪检测细胞表面抗原如CD29、90、105不同程度的阳性表达。两种细胞都具有一定的多向分化能力，在特定条件下可分化为脂肪细胞和成骨细胞。构建的组织工程皮肤具有复层表皮，移植裸鼠创面后能够促进创面愈合。
　　结论：羊膜间充质细胞和羊膜上皮细胞能够在体外分离、培养、扩增，并且具有干细胞特性。利用上述两种细胞构建的组织工程皮肤移植裸鼠创面后取得一定的修复效果，羊膜细胞构建的组织工程皮肤在再生医学和组织工程有很好的应用前景。

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缩略语表

中文摘要

英文摘要

前言

文献回顾

一、组织工程皮肤的发展及现状

二、羊膜上皮细胞和羊膜间质细胞的干细胞特性

三、羊膜细胞在再生医学中的应用

正文

第一部分 羊膜上皮细胞及间充质细胞的分类培养及鉴定

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分 利用羊膜上皮细胞和间充质细胞构建组织工程皮肤

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第三部分 利用构建组织工程皮肤修复裸鼠创面缺损

1 材料和试剂

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢