GSNO在糖尿病小鼠和非糖尿病小鼠心肌缺血/再灌注损伤中的作用及其可能机制

摘要

实验背景及目的
　　NO（一氧化氮）是体内的一种小分子量的气体信号分子，它在心肌细胞增殖/凋亡、心脏各种生理功能维持、病理状态下损伤/修复中都扮演着关键角色。然而，NO的生物学作用对于心脏来说是一把“双刃剑”。NO对心脏的生物学效应取决于其来源、浓度以及局部微环境的氧化还原状态密切相关。来源于eNOs（内皮型一氧化氮合酶）的NO可以激活线粒体KATP，减少心肌的线粒体通透性转换孔的开放，最终抑制心肌细胞的凋亡。然而，来源于iNOS（诱导型一氧化氮合酶）的NO可以激活MI/R（心肌缺血再灌注）损伤后的炎症反应，加重心肌损伤；外源性一定浓度的NO促进心肌细胞增殖,然而到达一定浓度后却促进心肌细胞凋亡；当周围环境存在过多的氧化应激产物，比如O2-（过氧阴离子）时，NO会与迅速反应O2-生成毒性巨大的ONOO-（过氧亚硝酸阴离子），ONOO-最终导致心肌损伤。因此,明确NO在心脏不同生理及病理状态下的作用及其机制将为我们提供以NO作为干预及治疗靶点的治疗心肌缺血缺氧损伤的新方法。
　　心血管并发症是糖尿病患者的“头号杀手”，65％的糖尿病患者死于心血管意外。大量研究表明,糖尿病患者容易发生心肌梗死，且心肌梗死后发生心衰的可能性增加。这些研究表明,糖尿病心肌对缺血性损伤的易感性增加。因此，寻找能够降低糖尿病心肌对缺血性敏感性的方法将最终能降低糖尿病心肌梗死患者的预后。有研究表明，过表达eNOS（一氧化氮合酶）可以增加肝脏抵抗I/R（缺血再灌注）损伤的能力；而过表达eNOS却降低糖尿病患者肝脏对I/R的抵抗力。这些结果可以看出糖尿病状态可以改变NO的生物学效应。以往的研究表明，NO可以减少正常心肌的I/R损伤而增加糖尿病心肌氧化应激水平。那么，糖尿病是否会改变NO对心肌的保护作用,且这种改变是否与糖尿病心肌氧化应激水平增加有关仍不得而知。
　　氧化/硝化应激是心肌缺血性损伤的重要调节因子。NO可以与局部过多的ROS产物，如O2-，反映生成具有毒性很强的ONOO-，ONOO-不仅通过破坏DNA损伤细胞,而且ONOO-还可以使蛋白质发生硝基化修饰,这种蛋白质的硝基化修饰可以在机体生理、病理信号通路中发挥关键的作用。硫氧还蛋白（thioredoxin,Trx）是一种在所有细胞中广泛表达的小分子蛋白。Trx不仅参与体内抗氧化过程，而且参与细胞凋亡的调控，Trx的酪氨酸残基可以被硝基化，导致Trx活性消失。大量研究表明，糖尿病心肌中硝基酪氨酸水平增加；且这种硝基化应激导致的Trx硝基化失活可能是糖尿病心肌对缺血性损伤易损性增加的原因之一。那么，是否糖尿病改变外源性NO对糖尿病心肌I/R损伤的作用也与Trx硝基化修饰失活有关仍不清楚。
　　因此，本研究拟通过动物模型：1）是否外源性NO对正常及糖尿病小鼠心肌I/R具有相反的作用。2）阐明糖尿病改变NO的心脏保护作用机制。
　　试验方法
　　实验一：小鼠糖尿病模型及MI/R模型的建立：1、腹腔注射链脲佐菌素(STZ,以0.1mol/L柠檬酸缓冲液溶解)，剂量为40mg/kg体重；对照组注射等量柠檬酸缓冲液。连续注射5天。2、用异氟烷吸入法麻醉小鼠后，开胸暴露心脏,采用6-0丝线在小鼠冠脉左前降支距根部2-3mm处打一活结造成心肌缺血,30min后，将活结打开进行再灌注模型的建立。成功建立1型DM（糖尿病小鼠）和小鼠心肌I/R模型。
　　实验二：糖尿病对心肌氧化应激水平及MI/R的影响：糖尿病小鼠以及相同年龄的非DM小鼠进行MI/R，再灌注3h后心肌分别检测以下指标：心肌细胞凋亡，caspase-3活性，超氧化物含量；再灌注24h后用于检测心梗面积。
　　实验三：GSNO（S-亚硝基谷胱甘肽）对DM以及非DM小鼠MI/R的影响：糖尿病小鼠以及相同年龄的非DM小鼠进行MI/R，再灌注10min前腹腔注射GSNO，再灌注3h后心肌分别检测以下指标：心肌细胞凋亡，caspase-3活性，超氧化物含量，硝基酪氨酸含量，Trx活性、Trx硝基化水平；再灌注24h后用于检测心梗面积；为进一步阐明GSNO对糖尿病小鼠MI/R的影响机制，DM小鼠进一步增加如下实验：再灌注10min前腹腔GSNO联合氧化清除剂（Mn(Ⅲ)TBAP）注射，检测指标同上。
　　实验结果
　　1、小鼠DM及I/R模型的建立
　　连续腹腔注射STZ（链脲佐菌素）5天，观察2天后,鼠尾取血采用罗氏血糖仪及配套试纸测定血糖。空腹血糖高于11.1mmol/L且出现典型的DM“三多一少”（多饮,多尿,多食,体重减轻）症状，DM模型制备成功。小鼠行MI/R后，其心肌经过伊文氏蓝/TTC（2,3,5-三苯基氯化四氮唑）双染后分别呈现白色、红色及蓝色，分别代表梗死区、缺血区域及正常区域，证明模型建立成功。
　　2、糖尿病对心肌氧化应激水平及I/R的影响
　　与Control+Sham组相比,DM+Sham组心肌组织超氧阴离子增加（P<0.05），差异有统计学意义；行MI/R后，与Control+MI/R组相比,DM+MI/R组心肌梗死面积增加（P<0.05），心肌细胞凋亡增加（P<0.05），心肌组织caspase-3活性增加（P<0.05），心肌组织超氧阴离子进一步增加（P<0.01），差异均有统计学意义。
　　3、GSNO对DM以及非DM小鼠MI/R的影响及可能机制
　　1）GSNO减少非糖尿病小鼠MI/R损伤,但增加糖尿病小鼠MI/R损伤：
　　与Control+MI/R+Vehicle组相比，Control+MI/R+GSNO组心肌梗死面积减少（P<0.05），心肌细胞凋亡降低（P<0.05），心肌组织caspase-3活性降低（P<0.05），差异均有统计学意义；与DM+MI/R+Vehicle组相比,DM+MI/R+GSNO组心肌梗死面积增加（P<0.05），心肌细胞凋亡增加（P<0.05），心肌组织caspase-3活性增加（P<0.05），硝基酪氨酸（nitrotyrosine）浓度增加（P<0.05），差异均有统计学意义；与Control+MI/R+GSNO组相比，DM+MI/R+GSNO组硝基酪氨酸水平增加（P<0.01），硫氧还蛋白硝基化增加（P<0.01），硫氧还蛋白活性降低（P<0.01），差异均有统计学意义。
　　2）Mn(III)TBAP减少GSNO增加的糖尿病小鼠MI/R损伤
　　与DM+MI/R+GSNO组相比,DM+MI/R+GSNO+Mn(III)TBAP组心肌梗死面积减少（P<0.05），心肌细胞凋亡减少（P<0.05），心肌组织caspase-3活性减少（P<0.05），超氧化物浓度减少（P<0.05），硝基酪氨酸（nitrotyrosine）浓度减少（P<0.05），硫氧还蛋白硝基化减少（P<0.05），硫氧还蛋白活性增加（P<0.05），差异均有统计学意义。
　　结论
　　NO供体GSNO增加糖尿病小鼠MI/R损伤，但是减少非糖尿病小鼠MI/R损伤；其机制可能与糖尿病心肌氧化应激水平增加有关，外源性NO与体内O2-反应生成ONOO-，最终导致Trx硝基化失活。

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前 言

文献回顾

1、糖尿病已成为心血管疾病的一个重要危险因素。

2、NO在非糖尿病动物中具有抗凋亡、抗心肌缺血的作用，因此，被认为

3、硫氧还蛋白被认为对正常小鼠心肌有保护作用,但是否参与了NO对DM

4、研究认为超氧化物参与NO对DM心肌的影响，但其具体过程并没有确切依据

正 文

第一部分动物模型的建立

1 材料

2 方法

3 结果

第二部分 GSNO 在糖尿病小鼠和非糖尿病小鼠心肌缺血/再灌注损伤中的作用及其可能机制

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

结论

参考文献

研究成果

致谢