E1A基因阻遏子基因抑制TNF-α诱导的骨髓间充质干细胞凋亡的作用与机制研究

摘要

目的:骨髓间充质干细胞（Bonemarrow-derivedmesenchymalstemcells，BMSCs）可以修复缺血损伤心肌的血管再生，改善损伤区域心肌的存活能力，可是BMSCs被移植到缺血损伤的心肌部位后存活率极低的现象却严重妨碍了其血管再生和损伤修复功能的发挥。研究发现：缺血心肌区域炎症反应所产生的炎性介质是致使移植的BMSCs大面积凋亡的重要原因之一。本室前期研究证实，E1A激活基因阻遏子（CellularrepressorofE1A-stimulatedgenes，CREG）具有抑制多种细胞凋亡的生物学功能。因此，我们希望探讨CREG修饰能否有效的抑制炎症因子所诱导的BMSCs凋亡及其调控机制。
　　方法:1应用原代培养的大鼠BMSCs为实验细胞模型。2应用表达CREG的腺病毒载体感染BMSCs，以制备CREG基因修饰的BMSCs，应用Westernblot方法鉴定CREG基因在BMSCs中的表达效率。3用FITC-AnnexinV/PI双染色法和TUNEL法检测添加20ng/mL肿瘤坏死因子-α（TNF-α）刺激10h后controlBMSCs组、normBMSCs组、GFPBMSCs组、CREGBMSCs组的BMSCs凋亡率。4Westernblot方法检测各相关蛋白的表达。
　　结果:通过FITC-AnnexinV/PI双染色法和TUNEL法研究发现，Ad-CREG瞬时转染的BMSCs可以有效抑制20ng/mLTNF-α刺激10h后诱导的凋亡，凋亡率明显低于其他三组并且具有统计学意义（P<0.05）。
　　通过Westernblot检测发现，正常的BMSCs在20ng/mLTNF-α刺激15min后细胞浆核转录因子κB（NF-κB）表达量开始减少，而NF-κB结合抑制蛋白IκB的磷酸化活化现象增加。normBMSCs组和GFPBMSCs组细胞胞浆蛋白NF-κB和IκB的变化与controlBMSCs组相似。与之相反，TNF-α刺激15min后，检测CREGBMSCs组的细胞胞浆蛋白发现，NF-κB表达未见显著减少，磷酸化的IκB表达也未见增加。进一步的核蛋白提取物检测研究发现，normBMSCs组和GFPBMSCs组的NF-κB蛋白在TNF-α刺激15min后在核内开始表达，而CREGBMSCs组则没有NF-κB蛋白入核转位的现象发生。
　　通过NF-κB的抑制剂二硫代氨基甲酸吡咯烷（PDTC）200μM与细胞共培养预处理进一步证明，CREG表达抑制TNF-α诱导的BMSCs凋亡是通过抑制NF-κB活化和入核转位完成的。CREG基因的表达抑制了NF-κB入核转录，从而使其调控的促凋亡相关蛋白（P53、Fas）激活的死亡受体通道活性降低，对抗了BMSCs凋亡的发生。
　　结论:BSMCs过表达CREG可以有效抑制炎性因子TNF-α诱导的凋亡，促使其能够在缺血心肌坏死后的移植治疗中存活并发挥作用。

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前言

文献回顾

1 骨髓间充质干细胞概述及其临床应用

2人E1A激活基因阻遏子（cellular repressor of E1A-stimulated genes, CREG）概述及最新研究进展

3 核转录因子κB（Nuclear translocation of the transcription factor

正文

实验一 过表达 CREG 抑制 TNF-α 诱导的骨髓间充质干细胞的凋亡

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 过表达 CREG 通过 NF-κB 信号通路抑制TNF-α 诱导的骨髓间充质干细胞的凋亡

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验三 过表达 CREG 抑制 TNF-α 刺激的 BMSC中 NF-κB 的核转位及相关凋亡蛋白的转录

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢