不同结构形式的HBx蛋白对其在肝癌细胞HepG2中分布的影响

摘要

目的：目的：HCC是一种全世界普遍的恶性肿瘤，经常被诊断出来时已到晚期，病死率高。目前的流行病学资料表明肝癌的发生率不断攀升，在接下来的十年中，不仅仅是亚洲，非洲，而且北美和欧洲的肝癌发生率也将会逐年增加。由于其对目前的化疗药物耐药，大多数患者都得不到有效治疗，其它的治疗方法例如切除，移植或经皮和动脉介入疗法其疗效都是极其有限。肝癌的危险因子主要包括：HBV，HCV，AFB1，化学致癌物—二乙基亚硝胺，酒精等。在中国，HBV感染是肝细胞癌（HCC）发生的主要危险因子，并且由其编码的HBx蛋白被认为介导了肝细胞的癌变。HBx蛋白能够引发肝癌发生发展的一个潜在的机制，可能涉及到其细胞内的分布。本研究选用不同的真核表达载体，分别克隆并构建了包含HBX基因或其与GFP以不同方式融合表达的重组质粒，探究不同结构形式的HBX蛋白对其在肝癌细胞内定位和分布的影响。
　　方法：
　　1以本实验室保存的的pcDNA3.0-HBX质粒为摸板，采用PCR方法扩增出Flag-HBX片段，克隆至pMD-18T载体中，测序正确后，分别亚克隆至不同真核表达载体，构建重组质粒pFlag-HBX-IRES2-EGFP，pEGFP-C3-Flag-HBX，pFlag-HBX-EGFP-N3。
　　2．将成功构建的三种真核重组表达质粒瞬时转染肝癌细胞HepG2，通过间接免疫荧光染色显示HBx蛋白的细胞内定位和分布，在CHKOlympus倒置荧光显微镜下观察并拍照，应用AdobePhotoshop7.0和ImageJ两个图像处理软件对照片进行处理。
　　结果：
　　1.三种真核重组质粒经测序，PCR和双酶切鉴定验证其含有HBX片段。
　　2.不同结构形式的HBx蛋白影响了其在肝癌细胞HepG2中的分布和表达水平。构建的pFlag-HBX-IRES2-EGFP质粒能分别表达HBx和GFP蛋白，并观察到GFP蛋白在整个HepG2细胞中是均匀分布的，然而HBx蛋白主要是呈颗粒状分布在细胞核周围。在pEGFP-C3-HBX-Flag质粒转染组中，GFP-HBX融合蛋白主要分布在核周围，呈粗颗粒状，核内有少许分布。在pEGFP-C3-HBX-Flag质粒转染组中，HBX-GFP融合蛋白基本上是均匀分布在整个HepG2细胞中，与以上两组明显不同。相似的是，在核周也有一些散在的颗粒存在，其数量在三组中居中。
　　结论：
　　1.为研究HBx蛋白在肝癌发生发展中的作用提供了有意义的实验依据，尤其是对体外细胞转染结果的解释提供了借鉴。
　　2.病理组织中HBx蛋白的分布检测结果与体外细胞转染实验的检测结果之间存在差异。
　　3.为了在体外实验中能更好地模拟真实的HBV感染情况，应更多的通过构建高频突变或缺失模式的HBx基因重组体混合物，进行低浓度转染。

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缩略语表

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前言

文献回顾

HBX 蛋白的结构和功能

HBx蛋白的分布与定位

HBx 蛋白肝脏致癌性的证据

HBx 蛋白诱导肝癌的形成机制—表观遗传学修饰

HBx 蛋白的抗凋亡效应

HBx 蛋白的促凋亡效应

HBx 蛋白羧基端的截短体

正文

不同结构形式的 HBx 蛋白对其在肝癌细胞 HepG2中分布的影响

实验一 含 HBX 基因的不同真核重组质粒的构建

1 材料

2 方法

3 结果

实验二 间接免疫荧光检测不同结构形式的 HBX蛋在 HepG2 细胞内的分布

1 材料

2 方法

3 结果

小结

参考文献

附录

个人简历和研究成果

致谢