单链抗体融合蛋白ScFv15-9R介导的siRNA/microRNA对HBV阳性肝癌细胞的干扰作用

摘要

乙型肝炎病毒的感染在中国是引发肝癌发生的最大原因。由于乙肝病毒的特殊复制过程及机体免疫细胞对病毒感染肝细胞的攻击，加之肝细胞具有的旺盛的再生能力，修复再生过程中基因突变累积，病毒基因的插入整合，造成肝硬化，肝癌。乙型肝炎病毒的表面蛋白分子HBsAg在肝癌患者的肝细胞上持续表达，肝癌患者临床样本100％检出HBsAg阳性。
　　新型的核酸分子药物包括：siRNA和miRNA。siRNA作为特异性基因沉默小分子核酸，通过与靶mRNA的严格互补配对，剪切并降解靶mRNA,降低目的蛋白的表达。miRNA分子是细胞体内内源性的小核酸分子，其通过不完全匹配结合目的基因的3’非编码区，抑制mRNA的翻译，从而降低目的基因的蛋白表达水平。一种miRNA可以作用于数个目的基因，调节细胞的生理过程，通常在病理变化的细胞组织中miRNA的水平也有所改变。依照其发挥的功能，补充或者降低miRNA的水平可以起到调节细胞功能的作用。
　　由于siRNA和miRNA本身对细胞没有选择性，加之核酸直接进入细胞效率低，需要有靶向输送系统加强siRNA/miRNA的细胞内化率并避免酶对siRNAmiRNA的降解。本课题为了使核酸分子对细胞组织具有靶向性，使核酸高效特异进入靶细胞，利用乙肝源性肝癌细胞表面表达HBsAg的特点，在人源HBsAg单链抗体基因3’端重组九聚精氨酸编码序列，在大肠杆菌表达系统进行表达，将其命名为ScFv15-9R。九聚精氨酸（9R）在生理条件下含有大量正电荷，可以依赖正负电荷相互作用而结合具有负电荷的核酸。表达的蛋白以包涵体形式存在，将包涵体蛋白经过变性纯化，再复性后，得到可溶性纯化蛋白。经过细胞ELASA和凝胶迁移实验证实，表达的蛋白既能识别并结合乙肝表面抗原HBsAg，又能结合小核酸分子。核酸结合量实验证实每分子蛋白大约能结合3分子的siRNA。荧光流式细胞术和免疫荧光实验证实该融合蛋白ScFv15-9R介导的小核酸分子能特异进入乙肝表面抗原阳性的肝癌细胞。
　　由于干涉靶点也是我们所关心的研究范围，因此我们选取与肝癌相关的基因c-myc作为靶点，通过单链抗体融合蛋白ScFv15-9R靶向介导的方式将c-mycmirRNA导入肝癌细胞系PLC/PRF/5，可以使细胞的周期得到阻滞，细胞增殖速度减慢，凋亡增加。
　　选取正常肝细胞高表达的而肝癌细胞中下调的microRNAmir-122，通过单链抗体ScFv15-9R靶向介导的方式可使肝癌细胞PLC/PRF/5生长受抑制，肝细胞的正常功能部分得到恢复。因此，可以证实我们所构建表达的新型单链抗体分子ScFv15-9R介导的靶向分子核酸结合活性，同时具有特异抗体靶向，为其临床应用奠定基础。

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缩略语表

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文献回顾

一、 肝癌病患现状

二、 肿瘤靶向治疗研究进展

三、 抗体介导的靶向性药物研究进展

四、 siRNA药物研究现状

五、 microRN药物研究进展

前言

正文

1. 材料

2. 主要试剂

3. 主要溶液配制

4. 主要仪器

第一部分 ScFv15-9R 重组基因的构建及融合蛋白的表达、纯化与复性

1. 实 验 方 法

2. 实 验 结 果

3. 讨 论

第二部分 ScFv15-9R 融合蛋白体外活性验证

1. 实 验 方 法

2. 实 验 结 果

3. 讨 论

第三部分 ScFv15-9R 融合蛋白携带siRNA/microRNA 对肝癌细胞的干扰作用

1. 实 验 方 法

2. 实 验 结 果

3. 讨 论

小结

参考文献

个人简历及研究成果

致谢