HCV core蛋白诱发肝脂肪变机制的初步研究

摘要

丙型肝炎病毒（hepatitisCvirus，HCV）感染严重影响着全球公共健康，全世界大约有17亿HCV感染者。HCV感染者中，约有80％发展为慢性丙型肝炎，至少有30％的HCV携带者发展成为更严重的肝病，如脂肪肝、肝硬化和肝癌。
　　HCV属于黄病毒家族中的肝病毒类，其病毒颗粒由一个9.6kb的正性的单链RNA片段包装折叠而成。其基因编码区的阅读框在翻译后可形成一个由3000个氨基酸组成的蛋白单体。此蛋白单体在翻译后可黏附于内质网膜上，并在宿主和病毒的蛋白酶的作用下转化为3个结构蛋白（core蛋白、E1、E2）和7个非结构蛋白（p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)。HCV可以分为7个主基因型和多个亚型。蛋白单体还可与细胞表面的特异性蛋白绑定，通过网格蛋白的内吞作用内化，从而启动生命周期。
　　HCVcore蛋白是22kDa的非糖基化蛋白，由靠近5`端的开放读码框编码。作为典型的黄病毒core蛋白，它富含赖氨酸和精氨酸（N端更明显））。它与RNA基因组结合而形成HCV病毒核衣壳。HCVcore蛋白的亚细胞定位在细胞质。但当其C端缺失时，可向核内迁移。这表明HCVcore蛋白可能在HCV致病过程中其到直接而关键的作用。
　　长期慢性的HCV感染者体内的HCV能够影响肝细胞内脂类代谢，从而导致脂滴在肝脏中的积聚。同时，肝细胞内的脂滴在HCV生命循环中也发挥着非常重要的作用。
　　HCV诱发脂肪肝、肝硬化最终形成肝癌的机理尚未阐明。普遍认为，HCV通过影响宿主肝细胞的脂代谢，诱发脂肪肝，并逐渐发展为肝硬化、肝癌。HCV诱发脂肪肝很可能与HCV蛋白和细胞脂代谢相关蛋白之间的相互作用有关。其中HCV的core蛋白是重要的致病因素，它涉及到脂滴累积，脂肪基因表达的改变和脂肪相关蛋白的活性。宿主基因表达对病毒生命周期有协助作用。长期肝脂肪变的存在可加速肝硬化和肝癌的进程。
　　异常的脂代谢能够加速肝病发展，而脂滴分子在HCV复制的过程中又发挥着关键作用。研究HCVcore蛋白诱发脂肪肝的分子机制就显得尤为重要。通过阐明HCVcore蛋白诱发脂肪肝的致病机理，控制感染，抑制脂肪肝的形成，并预防疾病进一步恶化，是目前世界上研究的热点问题。
　　值得注意的是，HCVcore蛋白3a亚型与其他亚型相比，能够更加强烈地诱导肝脏脂肪变的形成，但其基因序列与其他亚型相比，只在数量极少的若干个碱基上有差异。可推测这些差异碱基中具有与肝脂肪变相关的重要序列，但其通过何种机制发挥作用尚不明了。
　　本研究着眼于HCVcore蛋白3a亚型（HCVcore3a）诱发肝脏脂肪变的分子机制。我们构建了携带HA-HCVcore3a基因的重组腺病毒，以携带HA-HCVcore1b基因的重组腺病毒作对照，感染原位灌注分离的小鼠原代肝细胞。在感染24h，48h，72h时间点，分别观察感染HCVcore3a与HCVcore1b和正常肝细胞中脂滴的形成大小，数量等形态学特点。
　　PPAR-α是细胞核激素受体超家族的一员，是正常脂肪细胞分化过程中所必需的。核转录因子PPAR-α的主要功能是控制脂肪酸氧化和活化作用。PPAR-α缺乏会导致肝脏中脂肪酸氧化缺陷。因此，我们通过反转录和实时定量PCR技术，检测与脂代谢相关的宿主细胞受体PPAR-α和宿主基因ACC1和FAS的mRNA的表达量的变化，从而进一步探究HCVcore蛋白诱导肝脏脂肪变的分子机制。
　　【目的】
　　1.研究HCVcore3a蛋白在小鼠原代肝细胞中表达时诱导脂滴形成的大小，数量等形态指标；
　　2.通过实时定量PCR技术检测宿主细胞受体PPAR-α，宿主基因ACC1和FAS的mRNA的表达量，研究HCVcore蛋白与宿主细胞脂代谢之间的关系。
　　【方法】
　　1.构建携带HA-HCVcore3a和HA-HCVcore1b融合基因的重组腺病毒；
　　2.通过原位灌注分离小鼠原代肝细胞培养，并制作细胞爬片；
　　3.用携带融合基因HA-HCVcore3a和HA-HCVcore1b的重组腺病毒感染小鼠原代肝细胞；
　　4.在24h，48h，72h的时间点分别对原代肝细胞进行免疫荧光检测，观察原代肝细胞中脂滴形成的大小，数量等形态学特点；
　　5.培养小鼠肝细胞系AML12，并进行重组腺病毒的感染；
　　6.反转录受感染细胞中的mRNA为cDNA，进行实时定量PCR检测，以探究HCVcore蛋白在肝细胞内诱导脂肪变的分子机制。
　　【结果】
　　1.成功构建pAdEasy-HA-HCVcore3a和pAdEasy-HA-HCVcore1b重组腺病毒。
　　首先将全基因合成的HCVcore3a(1b)片段连入pCMV-HA载体中，并将HA-HCVcore3a(1b)片段整体转入穿梭质粒pshuttle-CMV中。利用穿梭质粒同源重组获得重组腺病毒质粒，经腺病毒包装和扩增获得高滴度的重组腺病毒。利用westernblot技术检测融合蛋白鉴定重组腺病毒包装成功。
　　2.相对于HCVcore1b，感染HCVcore3a重组腺病毒的小鼠原代肝细胞形成的脂滴增大，数量增加。
　　用pAdEasy-HA-HCVcore3a和pAdEasy-HA-HCVcore1b重组腺病毒感染小鼠原代肝细胞24h，48h，72h。结果显示，pAdEasy-HA-HCVcore3a与pAdEasy-HA-HCVcore1b感染相比，前者能够诱导形成体积较大的脂滴，并且脂滴数量明显增加。HCVcore1b与正常肝细胞相比也能诱导数量较少的脂肪变。
　　3.感染pAdEasy-HA-HCVcore3a重组腺病毒的小鼠肝细胞中PPAR-α的mRNA的表达量明显低于pAdEasy-HA-HCVcore1b感染的肝细胞以及正常原代肝细胞，同时ACC1表达量有所升高，但FAS的表达量变化不明显。
　　用pAdEasy-HA-HCVcore3a和pAdEasy-HA-HCVcore1b分别感染小鼠肝细胞系AML12。24h后利用实时定量PCR技术检测PPAR-α，ACC1和FAS的mRNA含量。发现3a亚型感染与1b亚型感染和正常细胞相比，PPAR-α的表达量明显降低。而ACC1表达量有所升高，但亚型之间相差不大，而FAS的mRNA的表达量变化不大。
　　【结论】本研究发现HCVcore3a在细胞水平上诱导肝脏细胞脂肪变的作用比HCVcore1b更强。在脂滴大小和数量上都可以明显地看出此趋势，其中HCVcore3a组脂滴大小为HCVcore1b组脂滴大小的4～6倍。HCVcore蛋白可能通过降低宿主细胞PPAR-α等相关蛋白的表达量发生作用，诱导脂滴形成，诱发肝脏脂肪变。

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缩略语表

中文摘要

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前言

文献回顾

1. HCV 的生命周期

2. HCV 感染的相关因素

3. HCV 诱导脂肪变

4. 脂肪变在肝细胞癌进展中的致病作用

5. 影响 HCV 感染中脂肪变的病毒和宿主因素

正文

实验一 携带 HCV core 蛋白 3a 和 1b 亚型重组腺病毒的构建

1.实验材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论：

实验二 HCV core 蛋白对小鼠原代肝细胞脂滴形态和数量的影响

0 引言

1 实验材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

实验三 HCV core 蛋白诱发肝脂肪变与宿主细胞的关系

0 引言

1 实验材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢