RU486在1型糖尿病大鼠神经病理性痛及认知功能障碍中的作用

摘要

糖尿病（diabetesmellitus，DM）是一种临床常见的代谢性疾病，患病率及患病人数呈逐年上升趋势，预计2030年DM患者可达3亿7千多万。DM患者可出现广泛的周围神经系统病变以及中枢神经系统（centralnervoussystem,CNS）病变，周围神经病变主要以感觉异常为主，约40～50％周围神经病变患者可出现糖尿病神经病理性痛（painfuldiabeticneuropathy，PDN），患者肢体末端常有烧灼感以及自发痛、诱发痛等痛觉过敏表现，长期的慢性痛甚至可以影响患者精神状态，导致患者精神抑郁等。DM的CNS病变可导致患者海马区结构和功能受累，认知功能下降，出现信息处理能力减退、学习记忆功能下降等临床表现。PDN长期迁延不愈，加之认知功能减退，严重削弱患者学习、工作以及社会交往能力，影响患者心理健康，大大降低生活质量。然而，迄今为止，DM引发PDN及认知功能减退的神经机制仍不完全清楚。
　　DM状态下糖皮质激素水平明显增高，而糖皮质激素增高参与了多种神经病理性痛以及认知功能障碍的发生。胶质细胞活性状态可影响神经元对痛信号以及高级脑功能神经信号的传递、调制。作为胶质细胞的一员，星形胶质细胞大量表达糖皮质激素受体（glucocorticoidreceptor，GR），星形胶质细胞的活性不仅受糖皮质激素调节也与N-mycdownstream-regulatedgene2（NDRG2）密切相关。此外，有研究发现，NDRG2也受糖皮质激素调节。因此糖皮质激素直接和（或）间接通过NDRG2蛋白调节星形胶质细胞活性可能是DM状态下糖皮质激素调节神经病理性痛以及认知功能的重要机制。脊髓是痛信息加工和调节的“初级门户”，海马是学习记忆等高级脑功能的重要“整合中枢”。因此，本课题拟通过GR拮抗剂RU486干扰神经组织的糖皮质激素信号系统，在脊髓和海马水平分别研究RU486对DM大鼠神经病理性痛以及认知功能障碍的作用，并从星形胶质细胞角度探讨其作用机制。
　　材料和方法：雄性SD大鼠禁食8h后腹腔单次注射链脲佐菌素（streptozotocin，STZ），48h后检测血糖，以血糖浓度大于15.0mmol/L作为DM模型成功标准，并监测大鼠血糖、体重、糖皮质激素水平。
　　采用STZ诱导的DM大鼠，探讨RU486在DM大鼠神经病理性痛中的作用及机制：（1）vonFrey纤维丝以及Hargreaves热辐射法分别检测DM大鼠成模28d后肢足底机械痛阈及热痛阈的变化；（2）鞘内置管，观察鞘内注射星形胶质细胞毒素L-α-aminoadipate（LAA）或RU486对DM大鼠机械痛域和热痛阈的影响；（3）免疫荧光组织化学法检测NDRG2与星形胶质细胞标识物胶质纤维酸性蛋白（glialfibrillaryacidicprotein，GFAP）或神经元标识物NeuN在脊髓背角的共存；（4）利用免疫组织化学染色、Real-timePCR以及Westernblot等方法检测GFAP和NDRG2在脊髓背角表达的变化。
　　在STZ诱导的DM大鼠上，观察DM大鼠认知功能变化以及RU486对DM大鼠认知功能的影响：（1）DM3月后水迷宫检测大鼠学习记忆能力；（2）观察皮下注射RU486对DM大鼠学习记忆的影响；（3）免疫荧光组织化学法检测NDRG2/GFAP及NDRG2/NeuN在海马区的共存；（4）利用免疫组织化学、Westernblot以及Real-timePCR等方法在蛋白和mRNA水平检测海马区GFAP和NDRG2的变化。
　　结果：（1）STZ诱导的DM大鼠血糖和糖皮质激素显著增高，体重增长缓慢。DM大鼠发病28d后出现了明显的机械痛敏和热痛敏，3个月后出现了明显的认知功能障碍；（2）脊髓背角和海马区域均观察到NDRG2与星形胶质细胞标识物GFAP大量共存，而与神经元标识物NeuN无共存，表明NDRG2表达于星形胶质细胞，而在神经元内无表达；（3）成模28d的DM大鼠（PDN大鼠）脊髓背角GFAP及NDRG2显著上调；而建模3个月的DM大鼠（认知功能障碍DM大鼠）海马区GFAP及NDRG2下调；（4）鞘内注射星形胶质细胞毒素LAA或GR拮抗剂RU486均能缓解DM大鼠机械痛敏和热痛敏。鞘内注射LAA抑制PDN大鼠脊髓背角GFAP的表达，抑制星形胶质细胞活性；鞘内注射RU486抑制PDN大鼠脊髓背角GFAP上调同时抑制NDRG2上调。（5）皮下注射RU486，可提高认知功能障碍DM大鼠的学习记忆能力，同时观察到海马区GFAP及NDRG2的表达上调。
　　结论：（1）脊髓背角星形胶质细胞活化是DM大鼠神经病理性痛的重要机制；（2）RU486缓解DM大鼠神经病理性痛的部分机制是通过抑制星形胶质细胞活性来实现的；（3）RU486对脊髓背角星形胶质细胞活性的抑制可能与其下调DM大鼠脊髓背角NDRG2表达有关；（4）海马区星形胶质细胞活性降低是DM大鼠认知功能障碍的重要原因，恢复海马区星形胶质细胞活性是RU486改善DM大鼠学习记忆功能的重要机制；（5）上调海马区NDRG2表达可能是RU486恢复认知功能障碍DM大鼠海马区胶质细胞活性的重要机制之一。

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前言

文献回顾

第一部分 糖尿病神经病理性痛研究进展

一、PDN 的流行病学

二、PDN 的神经病理性改变

三、PDN 的痛敏发生机制

四、PDN 的检测与评估方法研究进展

五、DM 的早诊断与 PDN 预防

六、PDN 的治疗

七、小结

第二部分 糖尿病认知功能障碍研究进展

一、T1D 诱发认知功能障碍的临床表现

二、T1D 对海马区的影响

三、T1D 影响认知功能的病理生理学机制

四、小结

正 文

第一部分 RU486 在 1 型糖尿病大鼠神经病理性痛中的作用

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分 RU486 在糖尿病大鼠认知功能障碍中的作用

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢