NOK与EGFR在NSCLC表达相关性及高表达NOK细胞系SPC-A-1-NOK生物学特性研究

摘要

研究背景:受体酪氨酸蛋白激酶RPTKs(Receptor protein tyrosine kinases)在细胞生长过程中包括细胞迁移、细胞增殖与抑制细胞凋亡等方面发挥着重要的调节作用[1-3]。2004年,Liu[4]报道了一种新的具有受体酪氨酸蛋白激酶RPTKs样结构的蛋白NOK(Novel Oncogene with Kinase-domain)。NOK可转化NIH3T3和BaF3细胞并促进肿瘤的形成,诱发肿瘤细胞侵袭并转移至远处多个器官[5-6]。NOK在体内和体外均能促进细胞转化、肿瘤形成和转移[7-8]。NOK基因分子与FGF/PDGF受体超家族具有30％的同源性[9]。NOK可同时激活MAP激酶和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)信号通路[10]。因此,NOK介导的肿瘤形成可能是RPTKs诱导的肿瘤发展的一个例子。但NOK对肺癌细胞生物学特性的影响及作用机制目前研究尚少,尤其是在非小细胞肺癌NSCLC(non-small cell lungcancer)中分级分期的基因表达及与EGFR的关系仍不清楚。NOK蛋白缺少胞外配体结合区,通过何种途径激活及调节其下游信号通路尚不清楚。
　　目的:探讨NOK与EGFR蛋白在肺腺、鳞癌组织和肺腺癌细胞系中是否存在共定位现象。明确NOK与EGFR基因在非小细胞肺癌组织中表达是否存在相关性。建立稳定高表达NOK蛋白的SPC-A-1-NOK细胞系,观察NOK对SPC-A-1细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响,为进一步研究NOK与EGFR相关性及其作用机制、信号传导通路提供平台。
　　方法:1.激光共聚焦检测非小细胞肺癌组织中NOK与EGFR蛋白是否存在共定位。RT-PCR检测NOK与EGFR基因在非小细胞肺癌组织中的表达。2.电穿孔法将pcDNA3.1-NOK重组质粒转染进SPC-A-1细胞,稳定筛选建立高表达NOK肺腺癌细胞系SPC-A-1-NOK;通过RT-PCR、Real Time-PCR及Western blot方法检测SPC-A-1-NOK细胞中NOK表达情况。激光共聚焦检测SPC-A-1-NOK细胞中NOK与EGFR蛋白是否存在共定位。3. MTT法测定细胞生长曲线检测细胞增殖能力。流式细胞术检测细胞周期和凋亡。细胞划痕试验和Transwell试验检测细胞迁移能力。细胞Matrigel试验检测细胞侵袭能力。
　　结果:1.NSCLC组织经NOK和EGFR双免疫荧光染色,激光共聚焦成像,显示NOK与EGFR蛋白在肺癌组织中表达存在共定位现象。运用RT-PCR检测,显示NOK与EGFR基因在肺腺癌组织不同TNM分期中的表达存在相关性(spearman秩相关检验相关系数rs为0.720,P＜0.001)。2.通过RT-PCR、Real Time-PCR及Western blot检测证实建立的SPC-A-1-NOK细胞系为稳定高表达NOK的细胞系。SPC-A-1-NOK细胞经激光共聚焦成像,显示NOK与EGFR蛋白在SPC-A-1-NOK细胞中存在共定位现象。3.应用MTT法检测细胞增值能力,绘制增殖曲线显示: SPC-A-1-NOK细胞增殖曲线明显较其余两组高,且陡。流式细胞仪检测细胞周期和凋亡,SPC-A-1-NOK细胞中处于S期的细胞较两对照组增多(28.00±1.42VS23.75±1.20、24.93±1.57,均P＜0.05);增殖指数PI升高(56.70±1.43VS46.89±1.19、46.47±1.32,均P＜0.05),处于Q2、Q4期的细胞减少(4.0±0.2VS8.4±0.5、7.9±0.4,均P＜0.05)。4.细胞划痕试验显示: SPC-A-1-NOK细胞较两对照组细胞迁移速度明显加快。细胞Transwell试验显示:转染组SPC-A-1-NOK细胞同两对照组细胞相比,穿膜细胞数明显增加(68.6±7.3VS36.7±4.3、38.4±5.9,均P＜0.05)。细胞Matrigel侵袭试验显示:转染组SPC-A-1-NOK细胞同两对照组细胞相比,穿过铺有Matrigel的Transwell小室的细胞数明显增加(46.8±6.21VS17.5±3.28、16.23±4.1,均P＜0.05)。
　　结论:1.在肺腺、鳞癌组织和肺腺癌SPC-A-1-NOK细胞系中NOK与EGFR蛋白表达存在共定位现象。在肺腺癌组织不同TNM分期中,NOK与EGFR基因的表达存在相关性。提示NOK与EGFR有相互作用的可能。2.NOK高表达肺腺癌SPC-A-1-NOK细胞系建立成功,为下一步实验奠定了良好基础。3.NOK可促进SPC-A-1细胞的增殖、抑制SPC-A-1细胞的凋亡,并提高SPC-A-1细胞的迁移和侵袭能力。

目录

缩略语表

中文摘要

英文摘要

前言

文献回顾

实验一 NOK 与 EGFR 在肺癌组织中相关性研究

1 材料和试剂

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 NOK 高表达肺腺癌细胞系的筛选及建立

1 材料和试剂

2 方法

3 结果

4 讨论

实验三 SPC-A-1-NOK 细胞系的 NOK 表达鉴定

1 材料和试剂

2 方法

3 结果

4 讨论

实验四 NOK 对 SPC-A-1 细胞增殖和凋亡的影响

1 材料和试剂

2 方法

3 结果

4 讨论

实验五 NOK 对 SPC-A-1 细胞迁移和侵袭的影响

1 材料和试剂

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献