耳蜗雪旺细胞来源的Wnt1对耳蜗移植干细胞分化的影响及其分子机制研究

摘要

1、目的：神经干细胞(neural stem cells, NSC)的移植为神经系统退行性疾病和损伤的治疗提供了新的思路,但是移植入内耳的神经干细胞向神经元分化的效率很低,这成为移植的外源性神经干细胞替代治疗螺旋神经神经元(spiral ganglion neurons, SGNs)变性的主要障碍。在本研究中,我们验证了耳蜗螺旋神经元损伤后的局部微环境更有利于移植的外源性神经干细胞向神经元方向分化,并初步阐明了其分子机制。
　　2、方法：我们通过向耳蜗圆窗龛局部给予药物ouabain建立大鼠螺旋神经元损伤动物模型。然后将分离、培养的神经干细胞移植进入正常、及螺旋神经元损伤后的耳蜗鼓阶。用免疫荧光染色和实时定量RT-PCR等技术来鉴定螺旋神经元损伤后内耳局部微环境对移植的神经干细胞分化的的影响,并初步阐明其分子机制。最后我们使用transwell共培养系统通过体外实验验证我们的假设。
　　3、结果：通过将外源性干细胞植入螺旋神经元损伤的动物耳蜗内,我们发现,与对照组耳蜗相比,移植的神经干细胞在螺旋神经元损伤耳蜗中更易分化成MAP2阳性的神经元。采用实时定量PCR和免疫荧光法,我们也证明了在螺旋神经元损伤耳蜗内,螺旋神经节内卫星细胞(雪旺细胞的一类,外周神经节内的雪旺细胞称卫星细胞)中Wnt1(Wnt信号通路配体)的表达显着增加。我们进一步证实,神经干细胞表达Wnt信号通路受体和Wnt信号通路胞内关键组件。在以上结果基础上我们提出假设,雪旺细胞所产生Wnt1可能参与了移植神经干细胞向神经元分化的调控。我们使用transwell共培养系统在体外验证这一假设。我们将感染了慢病毒载体高表达Wnt1的耳蜗雪旺氏细胞与神经干细胞共培养,结果显示:与高表达Wnt1的雪旺细胞共培养的神经干细胞,分化为MAP2阳性神经元的比例显着增加,然而这种促进分化的作用可被DKK1(Wnt信号通路抑制剂)抑制。
　　4、结论：这些结果表明,耳蜗雪旺氏细胞来源的Wnt1可激活移植神经干细胞的胞内Wnt信号通路,从而促进其向神经元的分化。详尽的阐明损伤微环境的改变对移植外源性干细胞的影响,有助于我们提出更有效的策略以突破移植神经干细胞向神经元的分化率低这一屏障。

目录

缩略语表

中文摘要

Abstract

前言

文献回顾

一、耳蜗移植干细胞的定向分化的调控机制

二、Wnt 信号传导通路

三、Wnt 信号传导通路对神经干细胞的影响

四、雪旺细胞及其在周围神经再生中的作用

五、耳蜗雪旺细胞研究现状

实验一 螺旋神经元损伤动物模型的建立、鉴定

1 材料

1.1 实验动物

1.2 主要试剂

1.3 主要仪器

2 方法

2.1 动物分组

2.2 ouabain 局部给药建立螺旋神经元损伤动物模型

2.3 听性脑干反应（auditory brainstem response，ABR）检测

2.4 基底膜铺片

2.5 毛细胞计数

2.6 免疫荧光染色、HE 染色

2.7 统计学方法

3 结果

3.1 ABR 阈值变化

3.2 耳蜗内、外毛细胞形态学观察

3.3 螺旋神经元形态学观察

3.4 螺旋神经节雪旺细胞形态学观察

4 讨论

实验二 螺旋神经元损伤对移植神经干细胞分化的影响

引言

1 材料

1.1 实验动物

1.2 细胞培养试剂

1.3 主要仪器

2 方法

2.1 嗅球神经干细胞的分离、培养

2.2 嗅球神经干细胞的鉴定

2.3 耳蜗干细胞移植实验动物分组

2.4 ouabain 局部给药建立螺旋神经元损伤动物模型

2.5 耳蜗神经干细胞移植

2.6 免疫荧光染色

2.7 神经元计数

2.8 统计学分析

3 结果

3.1 神经干细胞的培养与鉴定

3.2 神经干细胞移植后的耳蜗形态学观察

4 讨论

实验三 螺旋神经元损伤后 Wnt 通路分子的改变

引言

1 材料

1.1 实验动物

1.2 主要试剂

1.3 主要仪器

2 方法

2.1 动物分组

2.2 ouabain 局部给药建立螺旋神经元损伤动物模型

2.3 Wnt 信号通路相关分子 PCR 芯片检测

2.4 样品的 RNA 抽提

2.5 DNase I 消化 RNA 样品，去除其中可能含有的基因组 DNA

2.6 RNA 纯化

2.7 RNA 质量检测

2.8 cDNA 合成

2.9 实时定量 PCR

2.10 2-2deltCt 法数据分析

3 结果

3.1 总 RNA 的提取质量

3.2 PCR 产物特异性分析

3.3 Rat Wnt Signaling Pathway PCR Array 实验结果

4 讨论

实验四 耳蜗雪旺细胞释放 Wnt1 促进神经干细胞向神经元分化

引言

1 材料

1.1 实验动物

1.2 主要试剂

1.3 主要仪器

2 方法

2.1 动物分组

2.2 ouabain 局部给药建立螺旋神经元损伤动物模型

2.3 螺旋神经节组织的分离

2.4 组织标本总 R N A 抽提

2.5 总 RNA 定量

2.6 Real Time RT-PCR

2.7 RT-PCR

2.8 免疫荧光染色

3 结果

3.1 Wnt1 mRNA 相对含量的改变

3.2 Wnt1 在耳蜗中的表达部位

3.3 神经干细胞中存在 Wnt 经典通路关键分子

4 讨论

实验五 雪旺细胞促神经干细胞分化作用的体外实验研究

引言

1 材料

1.1 实验动物

1.2 主要试剂

1.3 免疫细胞化学染色抗体及试剂

1.4 病毒包装试剂

1.5 细胞培养仪器

1.6 病毒包装仪器

1.7 慢病毒载体系统质粒基本信息和图谱

2 方法

2.1 耳蜗雪旺细胞的分离和培养

2.2 耳蜗雪旺细胞的纯化

2.3 耳蜗雪旺细胞的鉴定

2.4 细胞纯度测定

2.5 慢病毒的生产

2.6 病毒液滴定测定

2.7 慢病毒感染目的细胞耳蜗雪旺细胞

2.8 Western Blot 试验

2.9 胚胎神经干细胞的分离、培养

2.10 transwell 共培养

2.11 免疫荧光染色鉴定神经干细胞向神经元的分化率

3 结果

3.1 耳蜗雪旺细胞的形态学鉴定

3.2 耳蜗雪旺细胞鉴定

3.3 病毒的滴度测定

3.4 慢病毒感染耳蜗雪旺细胞的荧光观察结果

3.5 慢病毒感染耳蜗雪旺细胞的 Western Blot 检测结果

3.6 共培养 4 d 后 MAP2 免疫荧光染色观察

4 讨论

小结

一、体内实验小结

二、体外实验小结

参考文献