单唾液酸神经节苷脂对浅低温体外循环大鼠海马神经元PI3K/Akt信号通路的影响

摘要

近年来，体外循环（CardiopulmonaryBypass，CPB）技术，在临床应用上得到了迅速发展，但CPB后脑损伤问题仍无法彻底解决，是目前临床上常见的严重并发症之一。所谓CPB脑损伤，亦称心脏手术后中枢神经系统功能障碍，是指心脏手术患者术后发生的急性和/或持续性的脑死亡、脑卒中、轻微的神经系统症状和神经心理障碍。术后认知功能障碍是CPB脑损伤最常见的并发症。有研究显示，术后1周认知功能障碍的发生率可高达50％～70％。但有关CPB脑损伤的病理生理机制、诊断技术、防治措施等相关问题始终困扰着临床，脑保护技术更是其中的热点和难点问题。
　　单唾液酸神经节苷脂（Monosialoganglioside1，GM1）是神经细胞膜上的一种鞘糖脂，参与多种生理功能，具有抗氧化和神经保护作用。有研究表明，用GM1预处理可以增强大鼠海马神经突触的传导性和可塑性，增加超氧化物歧化酶的活性、降低丙二醛（Malondialdehyde，MDA）的含量、减少细胞内钙超载，因而具有脑保护作用。相关研究发现，中低温CPB后1h和6h大鼠海马神经元可发生凋亡，有可能是引发脑损伤的机制之一。另有研究表明，GM1可激活磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（Phosphoinositide3kinase/proteinkinaseB，PI3K/Akt）信号通路，发挥抗细胞凋亡作用。故此，本研究拟通过构建大鼠浅低温非停跳CPB模型，研究GM1对浅低温CPB大鼠海马神经元的保护作用，并对其可能的机制进行探讨。
　　实验一：大鼠浅低温CPB模型的建立
　　目的：探索建立浅低温非停跳CPB实验模型的可行性和效果。
　　方法：选用清洁级健康成年雄性SD大鼠20只，从右颈静脉插管引流，右颈动脉插管灌注，以15ml6％羟乙基淀粉行无血预充建立CPB，转流60min。停转流2h后大鼠血压心率稳定视为模型成功。四肢连接心电图导联行心电监测，置直肠温探头行深部体温监测。左股静脉置管维持静脉通道，右股动脉置管监测动脉压及血气、电解质的变化。
　　结果：85％大鼠成功建立浅低温CPB模型，CPB过程中，大鼠生命体征平稳，生化指标正常，基本符合CPB建模标准。停转流后心肺功能平稳恢复，100％大鼠可存活到停CPB后3h。
　　结论：本实验建立的大鼠浅低温CPB模型与临床CPB基本一致，手术操作简单，术中管理稳定，可以作为研究CPB相关性器官损伤的良好模型。
　　实验二：GM1对浅低温CPB大鼠海马神经元的保护作用和对PI3K/Akt通路的影响
　　目的：探讨GM1对浅低温CPB大鼠海马的保护作用及其作用机制
　　方法：18只健康成年雄性SD大鼠，随机分为空白（C）组、单唾液酸神经节苷脂干预（G）组和体外循环（CPB）组。采用实验一建立的大鼠浅低温CPB模型。C组不行体外循环，其余操作同其它两组；G组行体外循环，在预充液中加入GM120mg/kg；CPB组行体外循环，在预充液中加入与G组相同体积的生理盐水。所有大鼠在停CPB后3h处死，取左侧海马组织，透射电镜下观察海马神经元细胞超微结构变化，TUNEL法染色观察海马神经元凋亡情况，免疫组化法检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3阳性细胞，Westernblot技术分析Akt、磷酸化AktSer473、磷酸化糖原合成酶激酶-3βSer9和Caspase-3蛋白表达。
　　结果：
　　1.电镜下海马神经元超微结构的改变
　　C组：细胞核圆形，核仁清楚，核内染色质分布均匀，核膜清楚，胞质内有丰富的线粒体、核糖体、粗面内质网、溶酶体等细胞器。
　　G组：神经元细胞核膜局部模糊，核内异常染色质较多，胞质内有较多线粒体、核糖体、粗面内质网、等细胞器，线粒体少量嵴减少。
　　CPB组：细胞核近圆形，未见核仁，核膜局部模糊，核内异常染色质凝聚、少量边集，胞质大部分溶解，尚存的线粒体嵴减少或空泡变性。
　　2.海马神经元凋亡情况
　　与C组比较，G组和CPB组凋亡细胞均增多（p<0.05）；G组与CPB组相比：凋亡细胞平均积分光密度（IntegratedODAverage，IA）值为8.08±0.80，比CPB组（13.95±1.20）降低42.08％（p<0.05）。
　　3.海马神经元Caspase-3阳性细胞的变化
　　与C组比较，G组和CPB组Caspase-3阳性细胞均增多（p<0.05）；G组和CPB组相比，Caspase-3阳性细胞IA值降低了34.71％（p<0.05）。
　　4.海马神经元Akt、pAktSer473、pGSK3βSer9和Caspase-3蛋白水平的变化
　　C组、G组和CPB组Akt蛋白水平无明显差异（p>0.05）；C组pAktSer473和pGSK3βSer9蛋白水平明显高于CPB组（p<0.05），且明显低于G组（p<0.05）。G组Caspase-3蛋白水平明显高于C组（p<0.05），但明显低于CPB组（p<0.05）。
　　结论：
　　1.浅低温体外循环可导致以大鼠海马神经元超微结构发生改变为标志的脑损伤，细胞凋亡可能是脑损伤的原因之一。
　　2.单唾液酸神经节苷脂可减轻浅低温体外循环脑损伤，其机制可能与激活PI3K/Akt信号通路，使pAktSer473蛋白表达上调，抑制GSK-3β活性和Caspase-3表达，减少细胞凋亡有关。

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实验一 大鼠浅低温 CPB 模型的建立

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 GM1对浅低温 CPB大鼠海马神经元 PI3K/Akt 信号通路的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历与攻读学位期间发表的文章

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