克罗恩病和肠结核患者单个核细胞miRNA的差异表达及临床意义

摘要

炎症性肠病（Inflammatory bowel disease，IBD）包括溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis，UC）和克罗恩病(Crohn’s disease，CD)，近年来在我国发病率逐年增多，其诊断和治疗方面依然存在许多难点。由于在我国肠结核（Intestinal tuberculosis，ITB）的发病率仍然很高，部分CD与ITB患者在临床表现、内镜及病理学改变方面极为相似，虽然目前国内外已有多种检查方法来区分两者，但鉴别诊断依然十分困难。
　　结核感染T细胞斑点试验（T-SPOT.TB）是目前诊断活动性结核感染最有价值的一种检查方法，通过结核杆菌特异性抗原CFP-10、ESAT-6的刺激后，患者外周血中被致敏的单个核细胞特异性地释放γ-干扰素，然后通过固像免疫显色形成沉淀斑点，从而判断是否存在隐性或现症感染结核。在目前临床应用中，国外报道中T-SPOT.TB检测的敏感性和特异性能达到95％以上，因此正逐渐得以推广。T-SPOT.TB技术是一个已经证实为很好的诊断结核的方法，但该技术在鉴别CD和ITB上仍无更多相关研究。我们首先探索了该技术在鉴别CD和ITB中的价值，结果提示T-SPOT.TB可很好区分明显活动性CD和ITB，但对活动程度较轻和缓解期的CD和ITB鉴别仍有困难。目前研究发现，microRNA（miRNA）在CD与UC中有作为分子标志鉴别诊断的作用，而且已经证实不同的miRNA在多种肿瘤中可作为分子标志物用以鉴别不同部位肿瘤，IBD组织中也有相对特异性的miRNA表达，是否在CD和ITB患者单个核细胞中存在不同的miRNA呢？经特异性结核抗原刺激后的CD和ITB患者单个核细胞中是否存在miRNA表达的差异呢？目前少见通过对比CD与ITB患者miRNA表达差异进行鉴别诊断的研究报道。我们通过对CD和ITB患者外周血单个核细胞受到结核特异性抗原CFP-10、ESAT-6刺激后所产生miRNA进行miRNA芯片表达谱分析，对差异表达的miRNA进一步在CD和ITB患者肠道手术病理组织中进行验证，以期在两种病变组织中找到有鉴别诊断价值的特异性miRNA，为鉴别诊断这两种疾病提供新的分子标志。
　　目的：
　　1．应用T-SPOT.TB方法研究该方法在鉴别诊断CD与ITB中的价值。
　　2．比较CD与ITB患者外周血单个核细胞经特异性结核抗原CFP-10、ESAT-6刺激后的miRNA表达谱。
　　3．应用Real-time PCR方法在CD和ITB患者肠道病变组织中验证差异表达的miRNA。
　　方法：
　　1．采集CD与ITB及肠外结核患者的外周血标本共126例，进行T-SPOT.TB检测；
　　2．以正常自愿者作为对照，采集3例正常自愿者、3例活动期CD与3例活动期ITB患者外周血分离提取单个核细胞，分别给予特异性结核抗原CFP-10以及ESAT-6刺激后培养；将两组培养后的细胞以正常自愿者组作为对照，进行miRNA芯片分析筛选；
　　3．应用生物信息学进行分析miRNA表达谱，找出表达有明显统计学意义的差异miRNA；
　　4．对表达差异的miRNA分别在5例正常人、5例CD和5例ITB肠组织标本中进行Real－timePCR验证。
　　结果：
　　1．确诊CD患者15例[11.9％（15/126）]，ITB患者14例[11.1％（14/126）]，肠外结核患者40例[31.7％（40/126）]。CD、ITB、肠外结核、其他疾病患者T-SPOT.TB阳性率分别为6.7％（1/15）、85.7％（12/14）、70％（28/40）、0％（0/57），各组间差异有统计学意义（P=0.001）。CD与ITB患者的T-SPOT.TB阳性率间差异有统计学意义（χ2=70.58，P=0.001）。T-SPOT.TB检测CD敏感性和特异性分别为93.3％（14/15）和87.5％（14/16），检测ITB时则分别为85.7％（12/14）和93.3％（14/15），CD的阴性预测值[87.5％（14/16）]高于ITB的阴性预测值[12.5％（2/16）]。以上结果提示T-SPOT.TB诊断TB的敏感性与特异性高，其有助于鉴别诊断CD和ITB。
　　2．提取3例正常人、确诊的3例活动期CD和3例活动期ITB患者外周血单个核细胞分为三组，其中3例正常人、确诊的3例活动期CD患者均进行T-SPOT.TB检测均为阴性，3例活动期ITB患者进行T-SPOT.TB检测均为强阳性。三组外周血单个核细胞经特异性结核抗原CFP-10、ESAT-6刺激后进行miRNA芯片分析筛选，miRNA表达谱结果发现CD与ITB对比，上调的miRNA有12个，下调的miRNA有10个，经抗原刺激后的CD与ITB对比，上调的miRNA有9个，下调miRNA的有1个，调控网络分析靶基因与差异miRNA的关系发现，上调与下调的miRNA分别有7个。最后综合分析后得到差异最显著的miRNA有5个，分别是miR-125b、miR-31、miR-19b、miR-939、miR-144。
　　3．Real-time PCR验证结果提示：miR-31、miR-19b、miR-939、miR-144在CD与ITB中对比并无明显差异，而miR-125b在CD和ITB组织的表达中有明显差异，在正常对照中,miR-125b均值=1.001，在ITB中miR-125b均值=1.161，CD中miR-125b均值=0.679，miR-125b在ITB中表达量水平明显高于CD组织，P<0.01，经统计学分析有显著意义。
　　结论：
　　1．T-SPOT.TB是活动性CD和ITB有效的鉴别诊断方法。
　　2．miR-125b在CD和ITB组织中表达有显著差异，miR-125b表达在ITB中显著高于对照，在CD中表达显著低于正常对照，miR-125b在ITB中的表达量明显高于CD，认为miR-125b可作为CD和ITB肠道病变组织中鉴别诊断的重要分子标志。

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声明

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缩略语表

中文摘要

英文摘要

前言

文献回顾

一、CD 的发病机制与诊断方法

二、ITB 的发病机制与诊断方法1．发病机制

三、CD 与 ITB 目前的鉴别诊断方法

四、miRNA 基因及其表达

五、miRNA 基因芯片的检测手段

六、miRNA 在 IBD 中的研究

七、miRNA 在肠结核中的研究现状

正文

第一部分 T-SPOT.TB 技术在鉴别诊断 CD 与ITB 中的价值

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分 基于 T-SPOT.TB 技术的 CD 与 ITB患者外周血单个核细胞的 miRNA 表达谱分析

1 材料

2 方法

3 分析

4 结果

5 讨论

第三部分 CD 与 ITB 单个核细胞表达差异miRNA 的鉴定

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢