肉毒毒素中和抗体的制备以及快速检验诊断方法的建立和应用

摘要

肉毒毒素（botulinum neurotoxins，BoNTs）由肉毒杆菌产生，是典型的A-B型神经外毒素，通过抑制神经肌肉接头处乙酰胆碱囊泡释放，阻断神经肌肉接头处的冲动传导，引起肌肉麻痹而致病。BoNTs是目前已知毒性最强的毒素（小于1μg即可以杀死一个成年人）。至今已发现有7种（A型、B型、C型、D型、E型、F型和G型）血清型的BoNTs，引起人类中毒的主要是A型、B型、E型和F型。BoNTs制备、运输及释放相对其他毒素容易，因此美国疾病控制中心将其列为A类的生物威胁，其中以A型军事意义最大，但是其他型别也不可忽视，若为稀有型别的毒素中毒流行则更应该怀疑可能是人为释放。
　　BoNTs是联合国《禁止生物武器公约》明确的重要生物战剂。毒性大，性质稳定。另外易于制备，易被恐怖分子获得，能够以气溶胶的形式散布，食物和水源易受其污染，是被用来作为生物战剂的主要毒素之一。因此，能检测到低剂量肉毒毒素的高灵敏度的方法对反生物武器战争和反恐怖袭击具有重要的军事意义。
　　肉毒毒素（结晶纯毒素）分泌时为相对分子质量（Mr）150，000的单链蛋白，被酶切为二硫键链接的双链之后被活化，其中重链Mr100,000，轻链Mr50,000。重链C端（C-terminal of heavy chain, HCC，Mr50,000）可以结合神经肌肉接头突触前膜上的神经节苷脂和膜蛋白，介导毒素的跨膜转运。毒素进入神经细胞内后，在锌离子存在的情况下，轻链可以水解SNARE蛋白，其中A、C和E型肉毒毒素水解SNAP25，而B、D、F和G型肉毒毒素水解VAMP2，从而抑制乙酰胆碱囊泡的释放，引起神经肌肉接头处的冲动传导障碍，肌肉麻痹。
　　近年来发现肉毒毒素具有较广阔的药用前景。A型肉毒毒素现已应用于痉挛性斜颈、面肌痉挛、局部肌肉痉挛、眼睑痉挛、多汗症以及眼科和耳鼻喉科疾病等的治疗。在美容方面，局部注射肉毒毒素可以减少皱纹的产生，最近发现其还可用于治疗慢性疼痛。其治疗的适应症仍在不断的拓展中，应对其滥用以及错用保持警惕，2006年美国曾报道了4例病人因注射未经注册的肉毒毒素制剂而导致的中毒。
　　目前没有特异的治疗药物可以预防或治疗肉毒毒素中毒，唯一有效的方法是及时注射相应型别的肉毒毒素抗血清或者抗体，可以减少神经损伤程度。由于其各型别型毒素之间交叉反应少，治疗需要相对特异的抗毒素血清，因此及时诊断并分型对治疗肉毒毒素中毒非常重要，快速、灵敏、特异的检测方法对肉毒毒素中毒防控意义重大。传统的小鼠生物学活性试验检测肉毒毒素存在诸多缺点，如实验所需要时间较长，影响因素多，对实验室条件要求较高，而且存在一定的假阳性率和假阴性率。国外多年来开发了多种实验室诊断方法，其中免疫学方法如酶联免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）及其改进方法应用最为广泛，其不仅可以检测有活性的毒素，并且对毒素分解产物或者失活毒素仍可检测，已被美国疾病控制中心采用的检测方法。另外，利用人工合成的毒素酶解底物片段，建立了肽链内切酶免疫检测方法，可达极高的检测灵敏度，但是有时可出现假阴性结果。
　　预先免疫类毒素或者重组疫苗可以用于保护肉毒毒素中毒，但是鉴于自然发生的肉毒毒素中毒十分罕见，群体免疫或者部队集体免疫肉毒毒素是不合适的。肉毒毒素中毒后症状进展迅速，中毒后免疫意义不大。预防和治疗肉毒毒素中毒最有效的办法是中毒前或中毒后早期注射中和抗体或者抗血清。已经在临床使用的包括马血清和人血清，分别用于成人和儿童中毒。但是马血清或者人血清来源和产量均受到很多限制，我国仅在兰州生物制品所和军事医学科学院贮备有马抗血清。单克隆抗体具有高特异性、高重复性、成分确定和易于规模化生产等特点，来源不受限制，可以进一步人源化，因此开发治疗性单克隆抗体是较为经济实用的途径。目前报道的单株单克隆抗体中和能力可中和10-100LD50的肉毒毒素，2株或更多株组合使用时可以极大地提高单克隆抗体的中和能力，为进一步生产治疗肉毒毒素中的制剂提供了可能。美国已报道3株识别A型肉毒毒素的中和性单克隆抗体的组合作为治疗性药物正在被美国FDA审查。
　　通过免疫肉毒毒素重链羧基端片段rHc和B细胞杂交瘤技术，我们获得了制备了56株针对A型肉毒毒素和40株针对F型的鼠源性单克隆抗体，分别命名为FMU-BTA1～56和FMU-BTF1～40。通过小鼠中和活性实验，确定56株抗 A型肉毒毒素的mAb混合后，每50μL抗体最高可中和2×104LD50的A型肉毒毒素，40株抗F型肉毒毒素的mAb混合后未滴定最高保护能力，但是也可中和超过100LD50的F型肉毒毒素（兰州生物制品所第五研究室提供）。其中FMU-BTA49单株可中和超过50LD50的A型肉毒毒素。3株具有中和活性的抗A型肉毒毒素mAb混合之后，每100μg最高可中和500LD50的毒素。
　　基于FMU-BTA和FMU-BTF系列单克隆抗体，分别开发了检测A型肉毒毒素的双单克隆抗体夹心 ELISA以及酶联免疫化学发光（Chemiluminescent immunoassay， CLEIA）试剂盒和检测F型肉毒毒素双单克隆抗体夹心ELISA试剂盒，其检测灵敏度都达到了小鼠活性实验水平，甚至检测BoNT/A的CLEIA试剂盒达到了0.1LD50/mL的极高灵敏度。我们建立的微孔板式ELISA和CLEIA检测BoNTs的方法具有特异性好、灵敏度高，用时较短和操作简单等优点，在公共卫生和军事侦察领域具有广阔的应用前景。

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文 献 回 顾

1 肉毒毒素概述

2 肉毒毒素中毒的检测

3 肉毒毒素中毒的预防和治疗

正文

第一部分 抗 A 型和 F 型肉毒毒素鼠源性单克隆抗体的制备和鉴定

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分 小鼠抗 A 型肉毒毒素单克隆抗体中和能力的鉴定

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论：

第三部分 检测 A 型肉毒毒素 ELISA 和 CLEIA方法的建立

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢